擬柱胞藻檢測技術改進

莆田市環境監測站 傅昶寧

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擬柱胞藻檢測技術改進

莆田市環境監測站 傅昶寧

近年來，在我國各地陸續發現擬柱胞藻水華，由于其具有一定的毒性，而且發生水華時肉眼不易發現，同時爆發時，藻密度通常能達到每升上億個細胞。該文根據與其它藻類不同的特性，提出了擬柱胞藻檢測方法，通過對傳統檢測方法的改進，證明了其實用性、準確性和簡潔性。

擬柱胞藻 檢測 鑒定 改進

1 概述

擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)，又名拉氏擬柱胞藻，為藍藻類原核生物念珠藻目念珠藻科柱胞藻屬。由于其在不同的環境下，形態變化較大，因此，在我國有中華尖頭藻和拉氏擬魚腥藻等多個名稱[1]。擬柱胞藻能夠產生Cylindrospermopsin（CYN）、麻痹性貝毒、類毒素-A等。其中CYN能導致肝腎損害，也有可能致癌，麻痹性貝毒和類毒素-A均為神經毒素。據報道，在澳大利亞棕櫚島，有149人出現了肝腸炎癥狀，這與被擬柱孢藻所產生毒素污染的飲用水有較大相關性。擬柱孢藻在溫帶和熱帶地區的淺水水域（如湖泊、水庫等）生長良好，一旦形成水華，數目巨大，如美國印第安納州發現擬柱胞藻的19個湖泊中，藻密度均達到每升上億個細胞[2]。近年來，在我國山東、湖北、廣東和云南等地陸續發現了擬柱胞藻及其水華。

由于擬柱胞藻通常不在水體表面形成明顯的浮膜，根據近幾年對莆田市東圳水庫拉氏擬柱胞藻的上百次日常檢定發現，若待到發現水體顏色變為較為明顯的黃綠色，則藻密度至少在2×108個細胞/升以上。一旦水華爆發，其藻類數量將占藻類總數的98%以上。因此，擬柱胞藻的檢測方法，在對水庫、湖泊水質的預警和水質評價中具有十分重要的意義。

2 擬柱胞藻檢測現狀

由于擬柱胞藻是發現能產生毒素的最新藍藻種類，在國內各項標準中均未見對擬柱胞藻的毒素或藻密度做出相關規定。在我國，福建、山東、湖北和云南等地發現了擬柱胞藻及其水華。本文在深入理解《水和廢水監測分析方法》（第四版增補版）中關于藻類檢測方法的基礎上進行了技術試驗，總結出鑒定擬柱胞藻并改進的快速檢測方法[3]。下面主要以莆田市東圳水庫的擬柱胞藻檢測為例進行說明。

3 擬柱胞藻檢測方法及改進介紹

3.1 儀器及試劑

奧林巴斯AX31顯微鏡，設備包括帶指示方框的10×目鏡，10×、20×、40×物鏡；

有機玻璃采水器；

分液漏斗；

0.1mL微量移液器；

50mL棕色標本瓶；

計數框：面積為20×20mm、容量為0.1mL，其內劃分橫直各10行格，共100個小方格。

22mm×22mm蓋玻片；

魯哥氏液（Lugols solution）：稱取4g碘及6g碘化鉀，溶于100mL純水中，避光保存。

福爾馬林固定液：將4mL福爾馬林（40%）甲醛和10mL甘油溶于86mL純水中。

3.2 水樣的采集及固定

用有機玻璃采水器采集100～2000mL水樣（視水中藻密度大小適當增減采水量），采樣后及時加入1%體積的魯哥氏液固定。如需長期保存，再加入幾毫升福爾馬林固定液，密封保存。

3.3 沉淀和濃縮

由于擬柱胞藻細胞個體小，且一旦形成水華，數目巨大，故根據藻密度，對固定后的水樣進行不同的處理。

當藻密度較低，即每升濃度低于10萬個細胞時，將水樣充分搖勻后，取1000mL在分液漏斗中沉淀，沉淀時間須滿48小時。在計數時，取沉淀物約30毫升，定容至50毫升。

當擬柱胞藻每升濃度處于10萬～30萬個細胞時，無需沉淀和濃縮，可直接進行鑒定。

當藻密度大于每升30萬個細胞時，根據實際需要進行稀釋，并補充適量的魯哥氏液進行染色固定。

3.4 擬柱胞藻的鑒定和計數

由于擬柱胞藻藻絲不易斷裂，將計數樣品充分搖勻后，迅速吸取0.1mL樣品到計數框中，蓋上蓋玻片。計數框中應無氣泡，也無樣品溢出。標本制成后，靜置幾分鐘，使藻體沉至框底，再進行鏡檢。

3.5 擬柱胞藻的鑒定

擬柱胞藻整條藻絲粗細均勻，藻絲通常寬2～3微米，長度變化較大，從10～120微米的都有。形態上，大部分為直線形，在某些地區會發現有卷曲形的[2]，有時可見異形胞。在其生長旺盛期，可見豐富的氣泡。擬柱胞藻的單個細胞長度范圍為3～10微米，由于其很少出現細胞收縮，故單個細胞往往很難區分。

圖1 直線型擬柱胞藻

圖2 卷曲形擬柱胞藻

圖3 直線型擬柱胞藻的異形胞

3.6 擬柱胞藻的計數

在東圳水庫，擬柱胞藻爆發期的藻密度通常在每升兩億個細胞以上，為了減少工作量，對傳統的計數方法進行了改進。

首先，根據擬柱胞藻的個體長度與細胞特性，計數時，顯微鏡目鏡使用10倍，物鏡使用20倍，依照目鏡行格法，間隔選取四個“半行格”（見圖4），先對藻絲的個體數進行統計。一個“半行格”內的個體數目一般不少于100個。圖4所示方法有以下三個好處：第一，在10×20倍放大倍數下，每個視野的直徑剛好等于1mm，即等于面積為20×20mm劃分成100方格后，每個方格邊長的一半，單次橫向的十格次視野，剛好是1/2行格，較之10×20倍放大倍數，一次橫向檢測所計視野面積大了一倍，大大減少了工作量，加快檢測速度；第二，擬柱胞藻的藻絲長度在該放大倍數下，較為清楚，同時，由于擬柱胞藻含有豐富的偽空泡，沉淀時間不足的情況下，藻絲常會懸浮在水中，常常出現分層現象，故需要在鏡檢計數過程中，需要不斷調整焦距，比起使用10×40倍的放大倍數，減小了調整幅度，使計數更為輕松快捷，減緩視力疲勞；第三，取不同行格的上下位置計數，能夠較為均衡準確地統計總數，使統計結果更具代表性和準確性。

統計完個體數后，轉換使用40倍物鏡，隨機選取若干個不重復視野，統計各視野內全部藻絲個體的細胞數和個體數，再進行換算。一般所參與此處統計的個體數不得少于30條。

由于擬柱胞藻很少出現細胞收縮，若按照傳統檢測方法，對細胞總數直接進行統計，工作量巨大，極大地影響了技術效率。每個樣品，各取樣和計數兩次，兩次結果與平均數之差應不大于±15%，否則須繼續取樣計數。

圖4 計數板上四個“半行格”的計數方法

3.7 計算結果

每升水樣中擬柱胞藻的數量按下式計算：

N=A/Ac×Vs/Va·n （1）

根據以上計數方法，一個計數框共含10行格，實計數2行格，在擬柱胞藻密度較高時，未進行稀釋的情況下，則（1）～（2）式可簡化為：

N=5×104·n （4）

依（3）和（4）式計算出水樣中的擬柱胞藻含量，并根據（3）式所得的個體平均細胞數對水庫水質未來幾日發展趨勢進行簡單的判定。

3.8 改進方法要點

第一，樣品中擬柱胞藻密度較低時，濃縮沉淀時間必須滿48小時。由于新鮮的擬柱胞藻富含偽空泡，固定時間不足的情況下，會有較多的細胞無法沉淀，從而導致濃縮后檢測結果偏小。

第二，在計數過程中，以計數框的四個“半行格”進行統計，不但不需要計算視野面積，無需配置臺尺和目尺，而且在充分體現了抽樣大小和代表性的情況下，通過實測兩行格的統計方式，大大減少了工作量，提升了工作效率。

第三，在日常藻類鑒定過程中，大多使用40倍物鏡進行計數統計，本文根據擬柱胞藻的個體長度及其在水華爆發時期會導致物種的多樣性和豐富性明顯下降[2]的特性，選擇使用20倍物鏡，不但可以清晰地看出擬柱胞藻的個體，同時還能在相同工作量下，增大計數面積，增加了統計結果的準確性和代表性。

第四，在計數方法上，不使用常規的按細胞計數，而是按照個體計數，再用個體總數乘以個體上的平均細胞數，來獲得統計數值。這樣做，既減少了由于藻細胞分隔不明顯，需要統計大量數值而容易出現的誤差和視覺疲勞，同時也極大加快了計數速度，及時有效地提供應急監測數據。而且，通過對個體上的藻體平均細胞數長期總結比較，根據擬柱胞藻的生長周期，可以在一定程度上對其未來幾日內的發展趨勢進行預報，為水質富營養化的預警提供了可能。

4 結語

經典藻類檢測方法在用于擬柱胞藻的檢測時，非常費時，常常滯后于生產和研究，特別是在爆發期，極大地影響了對富營養化問題的分析決策。本方法經過多次實驗后，證明了其實用、準確、簡潔等優點，測試結果可較為迅速地得出，作為對擬柱胞藻富營養化的水體進行的檢測是高效、可行的。

[1] 查廣才,楊東娟,鄒海鷹.擬柱胞藻的營養成分與培養[J]. 廣東農業科學，2010,37(8):6-8.

[2] William W. Jones，Sarah Sauter. Distribution and Abundance of Cylindrospermopsis raciborskii in Indiana Lakes and Reservoirs[R]. SPEA-Indiana University，2005，4/5：1-41.

[3] 國家環境保護總局.水和廢水監測分析方法（第四版增補版）[M].北京:中國環境科學出版社,2002.