非小細胞肺癌組織中Cyclin D1、p16蛋白的表達變化及意義

張永明，李 輝，楊文鋒，劉 杰，張百江

(山東省腫瘤醫院，濟南250117)

細胞周期蛋白Cyclin D1是原癌基因，其編碼的蛋白產物在細胞周期G1→S檢查點中發揮正性調控作用，啟動細胞周期并促進DNA合成，加速細胞增殖。p16基因作為腫瘤抑制基因，在許多人類原發性腫瘤和細胞株中的突變率為30% ～80%，該基因編碼的蛋白能特異性抑制細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK4)的活性，有效阻止細胞進入S期。本研究采用免疫組化法對非小細胞肺癌 (NSCLC)組織中的Cyclin D1、p16蛋白進行了檢測，觀察其表達變化并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2004年1月～2005年5月在山東省腫瘤醫院接受手術治療的NSCLC患者96例(均經病理檢查確診);男52例，女44例;年齡30～76歲。術前無放療、化療及其他抗腫瘤治療史。不吸煙和吸煙指數≤400年支者36例，吸煙指數＞400年支者60例。本組腫瘤直徑≤3 cm者27例、＞3 cm者69例;鱗癌28例，腺癌39例，細支氣管—肺泡癌13例，腺鱗癌11例，大細胞癌5例。按2009年NCCN制定的NSCLC分期標準分為Ⅰ期23例、Ⅱ期48例、Ⅲ期25例;組織學分級為Ⅰ級27例、Ⅱ級43例、Ⅲ級26例。發生淋巴結轉移57例，無淋巴結轉移39例。取15例良性肺部疾病患者的肺部正常組織作對照，其中肺炎性假瘤8例、肺硬化性血管瘤3例、肺結核4例。

1.2 Cyclin D1、p16蛋白檢測方法 兩組標本用10%甲醛固定，常規脫水透明，石蠟包埋，4μm厚連續切片。采用免疫組化SP法染色［兔抗人單克隆抗體Cyclin D1(即用型)、兔抗人單克隆抗體p16(即用型)、DAB顯色劑及SP試劑盒購自福州邁新公司］。用試劑盒提供的陽性切片(乳腺癌)作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。以細胞核或細胞質出現棕黃色為Cyclin D1、p16蛋白表達陽性。參考Mattern等［1］介紹的方法，采用陽性細胞半定量分級法對染色結果進行評定:未見細胞染色為0分、細胞輕度染色為1分、細胞中度染色為2分、細胞深度染色為3分;無陽性細胞為0分，陽性細胞＜25%為1分、26% ～50%為2分、≥51%為3分;上述兩分值相加，最高分為6分。高倍鏡(×400)下觀察10個視野并進行計分，取平均分值，得分0、1分為－，2分為+，3、4分為 ++，5、6分為 +++;+～+++判為陽性，－判為陰性。

1.3 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。計數資料比較用χ2檢驗，等級資料進行Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在NSCLC組織、肺部正常組織中，Cyclin D1蛋白呈陽性表達者分別為60、1例，p16蛋白呈陽性表達者分別為63、14例，兩種組織中兩個指標的表達相比，P均＜0.05。Cyclin D1蛋白的表達與NSCLC組織學分級及淋巴結轉移有關(P均＜0.05)，與其余病理參數無關(P均＞0.05);p16蛋白的表達與NSCLC臨床病理參數無關(P均＞0.05)，詳見表1。NSCLC組織中Cyclin D1、p16蛋白的表達呈負相關(rs= －0.298，P ＜0.01)，詳見表 2。

表1 Cyclin D1、p16蛋白表達與NSCLC臨床病理參數的關系(例)

表2 NSCLC組織中Cyclin D1、p16蛋白表達的關系(例)

3 討論

Cyclin D1蛋白與CDK4或CDK6在細胞G1期結合形成復合物，并作為視網膜母細胞瘤(Rb)編碼蛋白pRb的激酶，使其磷酸化后釋放出與其結合的轉錄因子E2F，驅動細胞由G1期進入S期，促進細胞增殖。Cyclin D1蛋白過表達是導致G1→S檢測點缺陷的主要原因。當Cyclin D1蛋白表達失控時，會導致遺傳基因突變和染色體結構異常的細胞獲得增殖，從而導致腫瘤的發生［2］。

研究［3］認為，Cyclin D1蛋白的過表達是NSCLC發生的一個早期分子事件。本研究檢測的NSCLC組織及肺部正常組織中Cyclin D1蛋白的表達與文獻［4～6］報道近似。Jin 等［7］研究發現，Cyclin D1 蛋白在肺鱗癌組織中的表達高于腺癌，但本研究無類似發現。Volm等［8］發現，在肺鱗癌組織中 Cyclin D1蛋白的表達與吸煙有關，而在肺腺癌組織中Cyclin D1蛋白的表達與患者吸煙無關。本研究結果顯示，Cyclin D1的表達與患者吸煙指數無關，與NSCLC組織學分級有關，與Betticher等［3］的研究結果一致。有研究［9］發現，NSCLC的轉移與Cyclin D1蛋白的陽性表達呈正相關，而且還與Cyclin D1蛋白表達的位置密切相關，即Cyclin D1蛋白對細胞周期的調控不單純限于時間上，還表現為空間調控。Jin等［7］發現，Cyclin D1蛋白表達在細胞質和細胞核內，一部分表達在核膜下，推測Cyclin D1蛋白在細胞質的表達可能是蛋白產生過多，也可能是核轉運信號的突變所致。本研究發現，部分NSCLC組織中癌細胞的細胞核呈棕黃色，于核邊緣近核膜處濃聚，在肺部良性病變組織中Cyclin D1蛋白位于胞質，具體機制不明。本研究發現，Cyclin D1蛋白表達與NSCLC 的淋巴結轉移有關，與文獻報道一致［5，10］。表明Cyclin D1蛋白在NSCLC中的過度表達，使腫瘤細胞增殖能力增強，有利于腫瘤的生長、浸潤和轉移。關于Cyclin D1蛋白過度表達與NSCLC分期及預后的關系，文獻報道一直存在分歧。本研究未發現Cyclin D1蛋白的表達與NSCLC臨床分期有關。

p16蛋白是多腫瘤抑制基因(MTSI)，通過抑制CDK4的活性而發回調節作用，而p16蛋白表達的生物學效應受Cyclin D1的影響，它可與Cyclin D1蛋白競爭調控CDK4/CDK6的活性，從而阻止、控制細胞分裂，誘導細胞分化，p16通過負性調節AUF1而控制Cyclin D1蛋白和 E2F1的表達［11］。p16基因突變和缺失引起p16蛋白非正常表達時，使細胞增殖失控，導致腫瘤細胞無限制性生長［12］。大多數惡性腫瘤存在p16蛋白表達下調。表明p16基因在腫瘤發生、發展過程中扮演重要角色［13］。本研究發現，p16蛋白在NSCLC組織中的表達減弱，其表達與患者年齡、性別、吸煙指數及NSCLC組織學分類、分級、臨床分期無關，這一結果與文獻報道近似［7，14］。Shapiro 等［15］發現，p16 基因突變與 p16 蛋白不表達率存在不一致性，p16基因的缺失出現率較p16蛋白表達缺失的出現率明顯降低，認為肺癌組織中p16蛋白表達缺失與p16基因的缺失關系不大，而與p16基因表達的調控關系密切，并認為p16蛋白的檢測比p16基因本身的檢測意義更大。本研究發現，NSCLC組織中p16、Cyclin D1蛋白的表達呈負相關，表明只有Cyclin D1和p16蛋白保持正負調節平衡，才能協調細胞的正常分化和增殖，它們的表達失衡將導致細胞周期失控而導致腫瘤的發生。

［1］Mattern J，Koomagi R，Volm M.Association of vascular endothelial growth factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell proliferation in human epidermoid lung carcinoma［J］.Br JCancer，1996，73(7):931-934.

［2］Hortwell LH，Kastan MB.Cell cycle control and cancer［J］.Science，1994，266(5192):1821-1828.

［3］Betticher DC，Heighway J，Thatcher N，et al.Abnormal expression of CCND1 and RB1 in resection margin epithelia of lung cancer patients［J］.Br JCancer，1997，75(12):1761-1768.

［4］Toyoshima F，Moriguchi T，Wada A，et al.Nuclear export of cyclin B1 and its possible role in the DNA damage-induced G2checkpoint［J］.EMBO J，1998，17(10):2728-2735.

［5］宋鑫，冀文茹，夏養志，等.p15、細胞周期蛋D1和轉移生長因子β1在非小細胞肺癌中的表達及其意義［J］.中華病理雜志，2001，30(3):218.

［6］Gautschi O，Ratschiller D，Gugger M，et al.Cyclin D1 in nonsmall cell lung cancer:a key driver of malignant transformation［J］.Lung Cancer，2007，55(1):1-14.

［7］Jin M，Inoue S，Umemura T，et al.Cyclin D1，p16 and retinoblastoma gene product expression as a predictor for prognosis in non-small cell lung cancer at stagesⅠ andⅡ［J］.Lung Cancer，2001，34(2):207-218.

［8］Volm M，Koomagi R.Association of Cyclin D1 expression in lung cancer and the smoking habits of patients［J］.Cancer Lett，1999，141(1-2):147-150.

［9］Pines J.Cell cycle，checkpoint on the nuclear frontier［J］.Nature，1999，397(6715):104-105.

［10］王靜，苗麗君，吳逸明，等.非小細胞肺癌組織中AKT2、Cyclin D1、MMP-9表達及其與臨床病理因素的關系［J］.癌癥，2006，25(1):69-72.

［11］Al-Khalaf HH，Colak D，Al-Saif M，et al.p16INK4positively regulates cyclin D1 and E2F1 through negative control of AUF1［J］.PLoSOne，2011，6(7):21111.

［12］Arifin M，Tanimoto K，Putra AC，et al.Carcinogenesis and cellular immortalization without persistent inactivation of p16/Rb pathway in lung cancer［J］.Int J Oncol，2010，36(5):1217-1227.

［13］Kamb A.Cell cycle regulators and cancer［J］.Trends Genet ，1995，11(4):136-140.

［14］時梅萍，林震瓊，陳崗，等.p16、Rb、CDK4和 Cyclin D1在非小細胞肺癌中的表達及其作用［J］.實用癌癥雜志，2000，15(2):132-133.

［15］Shapiro G，Edwards C，Kobzik L，et al.Reciprocal RB inactivation and p16INK4expression in primary lung cancers and cell lines［J］.Cancer Res，1995，55(3):505-509.