青蒿琥酯對人結腸癌HCT-8細胞誘導血管新生的影響及機制探討

黃偉煒，楊 瑩，劉 寧

(1海南省人民醫院，海口570311;2黑龍江護理高等專科學校)

青蒿琥酯是青蒿素的衍生物，具有良好的水溶性和抗瘧效果，同時表現出強大的抗腫瘤活性［1］。研究［1，2］發現，青蒿琥酯具有很強的抗結腸癌作用，但對于其抗癌機制尚不清楚。我們的前期研究結果表明，較低濃度(＜15μmol/L)的青蒿琥酯即可抑制體外培養的人結腸癌HCT-8細胞增殖、遷移［3］。2010年6月1日～2011年6月30日，我們觀察了青蒿琥酯對人結腸癌HCT-8細胞誘導血管新生的影響，并觀察了經青蒿琥酯作用的HCT-8細胞的血管內皮生長因子(VEGF)、血管生成素-2(Ang-2)的表達變化。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 青蒿琥酯購于桂林南藥股份有限公司(批號H10930195)，用于實驗時先用0.5%的NaHCO3溶解，再用生理鹽水配置成所需濃度。VEGF鼠單抗和Ang-2兔多抗購于Santa Cruz公司。EliViaionTMplus鼠/兔通用試劑盒和DAB顯色試劑盒購于邁新生物公司。

1.2 細胞培養 人結腸癌HCT-8細胞(由中國科學院生物化學與細胞生物學研究所提供)置含10%胎牛血清的RPMI1640培養液，于37℃、5%CO2培養箱培養。待細胞處于對數生長期時分組，青蒿琥酯組分別加入不同濃度青蒿琥酯，陽性對照組不加任何藥物;同時設陰性對照組(為單純RPMI1640培養基)。

1.3 大鼠主動脈環體外生長實驗 將青蒿琥酯組、陽性對照組細胞用RPMI1640沖洗3次，放入無血清RPMI1640培養液中孵育4 h;離心收集細胞后用無血清RPMI1640液稀釋至1×106/mL，繼續培養24 h。無菌條件下1 200 r/min和12 000 r/min分別離心10 min，獲得條件培養液。取1 mm長大鼠新鮮胸主動脈環30個，置入由纖維蛋白原、牛凝血酶、無血清培養液MCDB-131等混合制成的凝膠中，于37℃、5%CO2培養箱中孵育3 d。分別加入各組條件培養液，與大鼠主動脈環一起孵育。每日觀察新生血管生長情況，第14天血管生成達高峰，每組各取6個主動脈環，計數新生血管數。實驗重復3次，取均值。

1.4 雞胚絨毛尿囊膜(CAM)體內血管生長實驗雞胚孵化4 d，在近氣室處開口，暴露接種部位，置孵箱內穩定24 h后分組并作相應處理。①陰性對照組:將浸有RPMI1640、約1 mm×1 mm×1 mm大小的可吸收明膠海綿(無菌)置于雞胚接種部位。②陽性對照組:按照該實驗標準流程，在第6天將浸有100μL HCT-8細胞懸液的可吸收明膠海綿(無菌)置于雞胚接種部位。③青蒿琥酯組:將部分陰性對照組雞胚額外孵育1 d，分別給予100μL不同濃度青蒿琥酯處理后的HCT-8細胞懸液于可吸收明膠海綿上。上述三組雞胚用消毒的半透明封口膜封口，置孵箱中孵育，至第12天小心剝離各雞胚絨毛尿囊膜，固定后于400倍光鏡下觀察并拍照，管腔小于8個紅細胞大小且不帶肌層的小管腔血管為微血管，觀察5個高倍視野，取均值作為每例標本的微血管密度。實驗重復3次，取均值。

1.5 VEGF、Ang-2蛋白的檢測 采用 Western blot法。分別收集“1.2”的各組細胞，提取細胞總蛋白，定量后加入等體積2×上樣緩沖液，煮沸。取部分蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉，加入相應一抗，4℃過夜(β-actin為內參照)，洗滌后加入二抗，室溫孵育2 h，DAB顯色，IPP光密度分析軟件進行蛋白條帶的光密度檢測。用目的蛋白條帶與內參蛋白條帶的光密度比值表示目的蛋白的表達水平。

1.6 統計學方法 采用SPSS10.0統計軟件。實驗數據均以ˉx±s表示，樣本均數的比較用Dunnett＇s t檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青蒿琥酯對HCT-8細胞誘導的血管生成的影響 大鼠主動脈環體外生長實驗結果顯示，陽性對照組于第3天起鏡下可見有新生血管生成，第7～13天新生血管迅速增多，第14天后血管生成速度減慢、生成量逐漸減少;青蒿琥酯組新生血管形成時間明顯滯后，于第7～10天才見有新生血管出現，同時血管萌芽密度明顯降低，呈青蒿琥酯劑量依賴性。至第14天，陽性對照組新生血管數為(127.5±7.86)條，陰性對照組為(61.17 ±6.13)條，兩組相比P ＜0.01;3、6、12 μmol/L 青蒿琥酯組新生血管數分別為(55.23 ±3.68)、(32.84 ±4.13)、(12.66 ±2.71)條，與陽性對照組相比，P 均＜0.05;與陰性對照組相比，P＞0.05(3μmol/L青蒿琥酯組)和P＜0.05(6、12 μmol/L 青蒿琥酯組)

雞胚絨毛尿囊膜體內血管生長實驗結果顯示，與陰性對照組相比，陽性對照組可見有大量新生微血管呈放射狀排列于海綿周圍，血管密度增大、分支明顯增多、管徑增粗。陽性對照組新生血管數為(63.00±4.62)條，陰性對照組為(39.00 ±3.25)條，兩組相比，P＜0.01。青蒿琥酯組的血管密度、分支減少，管徑變細，3、6、12μmol/L青蒿琥酯處理組血管數分別(47.00 ±3.65)、(38.00 ±2.41)、(17.00 ±2.67)條，與陽性對照組相比(血管數分別減少22.9%、36.24%、74.82%)，P 均 ＜ 0.01;與陰性對照組相比，P＞0.05(3、6μmol/L青蒿琥酯組)和P＜0.05(12μmol/L青蒿琥酯組，血管數減少56.4%)。

2.2 青蒿琥酯對HCT-8細胞VEGF、Ang-2表達的影響 各組HCT-8細胞VEGF、Ang-2表達比較見表1。

表1 各組HCT-8細胞VEGF、Ang-2表達比較(ˉx±s)

3 討論

目前，手術切除仍是治療結腸癌的首選方法，但由于術后局部復發和轉移率較高，患者5年生存率仍較低。腫瘤浸潤和轉移依賴腫瘤新生血管的形成。研究［4］證實，結腸癌組織中存在明顯的血管新生現象。結腸癌組織微血管密度與結腸癌的臨床分期有關，是結腸癌獨立的預后因素［4，5］。本觀察結果顯示，陽性對照組HCT-8新生血管明顯多于陰性對照組和青蒿琥酯組，同時還高表達血管新生調控因子VEGF和Ang-2，進一步提示結腸癌細胞具有極強的血管新生促進能力。

體外實驗結果顯示，青蒿琥酯可抑制體外培養的骨髓瘤、白血病、卵巢癌細胞等誘導的血管新生［6～8］;體內實驗亦發現青蒿琥酯可抑制 Kaposi肉瘤鼠模型中腫瘤組織血管的生長［9］。在本研究中，大鼠主動脈環體外生長實驗結果顯示，與陽性對照組相比，青蒿琥酯組主動脈環上血管萌芽出現時間明顯延遲，密度低，且呈青蒿琥酯濃度依賴性。雞胚尿囊膜體內血管生長實驗結果顯示，與陽性對照組相比，青蒿琥酯組尿囊膜血管分支顯著減少，密度下降。上述體內、體外實驗結果均提示青蒿琥酯具有抗結腸癌HCT-8細胞誘導血管新生的能力。

血管新生受多種因素的調控，其中專一作用于血管內皮細胞的VEGF和Ang-2相互協調，在血管形成過程中起關鍵作用［10］。VEGF是經典血管生成促進因子，主要促進血管內皮增殖。Ang-2是近年發現的另一種對血管內皮有專一性的促血管新生因子家族成員，其主要作用是促進內皮細胞滲漏，誘使其出芽，與VEGF相互協調，促進血管新生。已經證實 VEGF 和 Ang-2 在結腸癌中呈高表達［4，11，12］。本研究結果顯示，較低濃度的青蒿琥酯(3μmol/L)即可抑制HCT-8細胞VEGF和Ang-2的表達。提示青蒿琥酯對HCT-8細胞誘導血管新生的抑制效應可能與其下調該細胞VEGF和Ang-2的表達有關，但其具體作用機制有待進一步研究。

綜上所述，青蒿琥酯不但可以抑制結腸癌細胞增殖、遷移，還對其誘導血管新生的能力有抑制作用。青蒿琥酯對結腸癌細胞誘導血管新生的抑制效應可能與其下調結腸癌細胞VEGF和Ang-2的表達有關。

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