結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p、SMO的表達變化及意義

蘇桂源，孫 凱，李國新，余 江

(南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院，廣州510515)

微小RNA(miRNA)是真核生物中一類長約22個核苷酸的非編碼小分子RNA，于轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達，其作為一類潛在的癌基因或抑癌基因參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程［1～3］。miRNA-338-3p(miR-338-3p)是新近發(fā)現(xiàn)的一種miRNA，其在結(jié)直腸癌中的表達情況及其調(diào)控靶目標的表達情況尚未見報道。Smoothened(SMO)蛋白是Sonic hedgehog(Shh)信號通路中的一個關(guān)鍵跨膜蛋白，具有開關(guān)該信號通路的作用;Shh信號通路異常激活可促進腫瘤細胞增殖、遷徙以及新生血管的形成［4，5］。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p及SMO的表達情況，為探討兩者可能的內(nèi)在調(diào)控關(guān)系提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2010年9～12月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者30例，男16例，女14例;年齡(58.8±11.2)歲。其中結(jié)腸癌19例，直腸癌11例。患者接受手術(shù)治療時，留取癌組織，同時取距離癌腫5 cm的腸黏膜(癌旁組織)及距離癌腫10 cm以上的腸黏膜(作為正常對照)。全部患者術(shù)前未接受放化療。標本采集后用DEPC水處理并快速置液氮中冷凍，－80℃保存。

1.2 引物設(shè)計與合成 自miRNA Base數(shù)據(jù)庫(http://microrna.sanger.ac.uk/)和 Genebank 查找基因序列，用Primer-Express 2.0軟件進行引物設(shè)計。miR-338-3p及內(nèi)參照RNU6B由GeneCopoeia公司設(shè)計合成。SMO上游引物為5'-TTACCTTCAGCTGCCACTTCTACG-3'，下游引物為 5'-GCCTTGGCAATCATCTTGCTCTTC-3'，擴增片段長 322 bp;內(nèi)參照GAPDH上游引物為5'-GCTCTCCAGAACATCATCCCTGCC-3'，下游引物為 5'-CGTTGTCATACCAGGAAATGAGCTT-3'，擴增片段長346 bp;上述引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3 miR-338-3p的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)。用Trizol抽提標本組織中的總RNA，使用Beckman Coulter DU800核酸蛋白分析儀測定 RNA濃度，RNA的 A260nm∶A280nm≥1.8，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳后取 28S、18S泳道的RNA條帶進行鑒定，實驗所用RNA具備較高的純度及完整性。使用All-in-OneTMmiRNA qRT-PCR Detection試劑盒進行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應和Q-PCR反應，嚴格按照說明書進行操作，每個標本均作復管PCR反應。用RNU6B作為內(nèi)參照。樣本中miR-338-3p的ΔCt值 =樣本中 miR-338-3p的 Ct值 －RNU6B的Ct值;因用Real-time Q-PCR來檢測RNA時，不同RNA樣本存在不同的逆轉(zhuǎn)錄效率，故以正常對照的腸黏膜ΔCt值進行校正，得出ΔΔCT值，ΔΔCt=(CtmiR-338-3p－ CtRNU6B)目的樣本－ (CtmiR-338-3p－CtRNU6B)校正樣本，各樣本中 miR-338-3p 的含量用 2-ΔΔCt表示。

1.4 SMO mRNA的檢測 采用半定量RT-PCR技術(shù)。取提取的總RNA 3μg作為模板合成cDNA，然后進行PCR。取擴增產(chǎn)物5μL行2.0%瓊脂糖凝膠電泳，用Pharmacia Master Image紫外凝膠成像系統(tǒng)進行電泳條帶分析。SMO mRNA相對含量=目的基因條帶積分吸光度值/內(nèi)參照GAPDH基因條帶積分吸光度值。每個樣本重復檢測3次。

1.5 SMO蛋白的檢測 采用Western blot。稱取標本組織100 mg，置高壓滅菌的研缽上，加液氮研磨成組織漿，加入蛋白提取液1 mL，充分攪勻后超聲破碎5 min，4℃、12 000 g離心10 min，收集裂解物總蛋白;凱基BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。取總蛋白50μg，加凝膠上樣緩沖液調(diào)整體積，于100℃加熱5 min，使蛋白完全變性。SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并原位電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，該膜經(jīng)5%脫脂奶粉封閉處理后，與兔抗人SMO多克隆抗體和內(nèi)參照β-Acion分別孵育。膜漂洗后分別與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的特異性二抗反應，增強化學發(fā)光法(ECL)顯影得到蛋白印記條帶，以Quantity One軟件檢測灰度值。每個樣本重復檢測3次。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。組間比較用配對設(shè)計兩兩比較t檢驗，相關(guān)性分析用Spearman相關(guān)分析法。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p的表達量為0.153 7 ±0.126 4，SMO mRNA 相對表達量為 0.371±0.116，SMO 蛋白灰度值為 3.195 ±1.623，癌旁組織分別為 0.901 5 ±0.426 3、0.366 ±0.117、0.733±0.305，兩種組織中的 miR-338-3p、SMO 蛋白表達相比，P均＜0.01;miR-338-3p與SMO蛋白的表達呈負相關(guān)(r= － 0.877，P ＜ 0.01)。SMO mRNA、SMO蛋白的電泳條帶見圖1、2。

圖1 SMO mRNA在結(jié)直腸癌及癌旁組織中的表達注:T1和N1、T2和N2、T3和N3分別為3例患者癌組織和癌旁組織中的SMO mRNA

圖2 SMO蛋白在結(jié)直腸癌與癌旁組織中的表達

3 討論

有學者［6］曾采用液相芯片技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，miR-338-3p在肝細胞癌組織中的表達顯著下調(diào)。本研究結(jié)果顯示，miR-338-3p在結(jié)直腸癌組織中的表達水平較癌旁組織顯著下降。提示miR-338-3p基因的表達缺失可能參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生及演進過程。miR-338-3p定位于染色體17q25.3，而染色體17q23-25位點常是多種惡性腫瘤的突變熱點，且其突變后的遺傳表型常與腫瘤的血管侵襲和遠處轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為密切相關(guān)［7］，此現(xiàn)象亦提示miR-338-3p可能參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的進程，而這亦與我們前期預實驗中所發(fā)現(xiàn)的miR-338-3p在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中表達水平更低的結(jié)果相一致。說明miR-338-3p可能是一種與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的抑癌基因。

Shh信號轉(zhuǎn)導通路主要由分泌型信號糖蛋白Shh配體、跨膜蛋白受體Ptch和另一跨膜蛋白SMO組成的復合物以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成［8］。其中SMO蛋白是Shh信號通路中關(guān)鍵的信號轉(zhuǎn)換器，具有調(diào)控Shh信號通路開或關(guān)的作用，即SMO蛋白能夠?qū)⒓毎獾腟hh信號轉(zhuǎn)換成細胞內(nèi)的Gli信號，從而啟動細胞核內(nèi)特異基因的轉(zhuǎn)錄，對Shh信號通路具有激活作用。研究［9］證實，Shh信號通路亦參與調(diào)控腫瘤細胞的運動、遷移和腫瘤血管形成，在腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，相應地激活或抑制Shh信號亦可促進或抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。我們通過TargetScan、PicTar、miRanda等生物信息學分析軟件篩選miR-338-3p的可能作用靶基因，發(fā)現(xiàn)miR-338-3p與SMO mRNA 3'非翻譯區(qū)(UTR)存在互補結(jié)合，提示SMO蛋白可能是miR-338-3p在結(jié)直腸癌中新的作用靶點，miR-338-3p可能通過調(diào)控SMO蛋白表達，進而影響結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的生物學行為。

miRNA主要通過切割降解和翻譯抑制兩種機制來調(diào)控其靶基因的轉(zhuǎn)錄后表達。由于絕大部分miRNA不能與其靶基因的轉(zhuǎn)錄體完全配對，故認為miRNA主要通過翻譯抑制的方式發(fā)揮生物學效應［10～12］。本研究證實，SMO mRNA 在結(jié)直腸癌和癌旁組織中的表達差異無統(tǒng)計學意義，但SMO蛋白卻在結(jié)直腸癌組織中表達顯著增高，再結(jié)合miR-338-3p表達下降且兩者之間存在明顯的負相關(guān)關(guān)系這一結(jié)果，推測miR-338-3p可能通過不完全互補配對方式與SMO mRNA 3'UTR結(jié)合，故僅能抑制SMO mRNA的進一步翻譯，但不能將其根本降解;而結(jié)直腸癌組織中由于miR-338-3p表達下調(diào)，從而未能于轉(zhuǎn)錄后水平沉默SMO蛋白表達，導致SMO蛋白表達上調(diào)，繼而異常激活Shh信號通路，促進結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織中miR-338-3p表達明顯下調(diào)，SMO蛋白表達明顯上調(diào)，miR-338-3p可能通過轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制使SMO蛋白表達下降，從而抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。此為結(jié)直腸癌發(fā)病機制和診斷治療的研究提供了新的思路和實驗基礎(chǔ)。

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