黏細菌93431次級代謝產物的分離純化及活性測定

劉 斌，王鴻鵬，陳 川，張利平，石 楠，湯 輝，郭立格

(河北大學生命科學學院，河北保定071002)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全球每年新診斷乳腺癌≥120萬例［1～3］。乳腺癌給患者帶來了巨大的痛苦。尋找治療乳腺癌的特效藥物一直是新藥研發的熱點。黏細菌是一類單細胞［4］、長桿狀［5］、可滑行運動［6］的革蘭陰性菌，在系統分類上屬于紫細菌類群的δ分支，共12個屬約40個種［7］。黏細菌以二等分分裂繁殖，大多生長在土壤中或食草動物的糞便上，有的能分解纖維素［8］。黏細菌具有產生活性物質種類多、結構新且菌株差異大的特點［2，3］。黏細菌能產生種類眾多的次級代謝產物，其中相當一部分代謝物具有抗真菌、抗細菌以及抗腫瘤等生物活性［9］，而且作用機制多種多樣，目前已經發現了約100種黏細菌次級代謝產物的基本結構和600種結構類似物［10］，為新結構或新作用機制生物活性物質的篩選提供了一類良好的微生物資源。黏細菌已經成為繼放線菌、芽孢桿菌之后的第三大次級代謝產物產生菌。為了尋找新的抗腫瘤活性成分，2011年8月3日～11月20日，我們對黏細菌93431的次級代謝產物進行了分離純化，從中分離到4種組分，利用MTT法對這4種組分的活性進行了檢測。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黏細菌93431菌株由河北省微生物多樣性研究與應用重點實驗室分離保存。

1.1.2 細胞 人乳腺癌細胞株MCF-7，人胚肺成纖維細胞株MRC，由武漢大學中國典型培養物保藏中心惠贈。

1.1.3 試劑及器材 種子培養基和發酵培養基的制作方法參見文獻［11］;D312大孔吸附樹脂(山東魯抗醫藥集團有限公司);RPMI1640培養液(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);分析型高效液相色譜儀(日立L-2000，DAD 檢測器，Thermo ODS-2，5 μm，250 mm ×4.6 mm);制備型高效液相色譜儀(美國SSI Prep Pump，Model 2001，GRACE Allsphere ODS-2，5 μm，250 mm×4.6 mm);自動離心濃縮儀(英國 miVac QUC-23050-100);顯微鏡(OLYMPUSBH-2 JAPAN);酶聯免疫檢測儀(德國BMG FLUOstar OPTIMA);冷凍干燥儀(SIM MCFD5508型)。

1.2 方法

1.2.1 黏細菌93431菌株發酵及其代謝產物的粗提 將93431菌種接種于CAS液體種子培養基，置于搖床中，28℃、200 r/min振蕩培養4 d。再將種子液以10%接種量接種到VY/2液體發酵培養基(裝液量300 mL)，搖床中28℃、100 r/min振蕩培養7 d。將發酵液4 800 r/min離心10 min，除去上清液，收集得到菌體及樹脂，向其加入15倍體積的甲醇，置于搖床上振蕩，過夜浸提，浸提液用薄膜旋轉蒸發儀濃縮，得到發酵產物的粗提物。

1.2.2 黏細菌93431菌株代謝產物的分離純化

將得到的發酵產物用分析型高效液相色譜進行梯度洗脫(流動相組分及其比例見表1)，初步了解發酵產物的組成成分。針對發酵產物中含量較高的組分，設計洗脫方法，利用制備型高效液相色譜對其進行分離制備。將收集得到的不同組分置于自動離心濃縮儀中，37℃真空離心濃縮，除去甲醇。－80℃低溫冰箱中過夜后，置冷凍干燥機中進行干燥，除去水分后得到干品。

表1 高效液相色譜梯度洗脫流動相組分及其比例

1.2.3 黏細菌93431菌株代謝產物活性測定及毒性檢測 93431菌株代謝產物的活性測定采用MTT法［12］。取對數生長期的MCF-7，用含10%胎牛血清的RPMI1640培養液配制成1×104/mL，每孔180 μL接種于96孔細胞培養板，置37℃、5%CO2培養箱中培養12 h。將分離得到的93431菌株代謝產物樣品用完全培養基溶解，0.22μm無菌濾膜過濾除菌后再將樣品稀釋成4個濃度梯度，分別為100、50、25、12.5 μg/mL。樣品組每孔加入 20 μL，每組設置4個復孔，以不加樣品的孔作為空白對照。37℃培養24 h后，倒置顯微鏡下觀察96孔板中各細胞形態的變化。然后每孔加入30μL的 MTT(5 mg/mL)液，繼續培養4 h，棄上清液，加 DMSO 150 μL/孔，將96孔板震蕩10 min后，492 nm波長測定光密度值(OD值)，按下列公式計算細胞抑制率:細胞抑制率=［1－(樣品孔OD值/空白對照孔 OD值)］×100%。93431菌株代謝產物的毒性檢測用MRC細胞模型，培養液改用含10%胎牛血清的DMEM，具體方法同上。

2 結果

2.1 93431菌株的性質及發酵培養結果 93431菌株為革蘭陰性菌，呈細長桿狀，在固體VY/2斜面上培養4～5 d即形成圓球形淺黃色子實體，無柄，較黏軟。發酵液呈淺黃色且清澈透亮。

2.2 93431菌株次級代謝產物的分離純化結果分離結果表明，93431菌株次級代謝產物成分比較復雜。對含量較高的組分即保留時間50～60 min的次級代謝產物進行分離。為了獲得93431菌株發酵產物中的單一化合物，利用制備液相對其進行分離制備，流動相比例調整為甲醇∶水=72∶28，經過制備液相分離純化，收集得到4種組分，即93431-1、93431-2、93431-3、93431-4，將這 4 種組分濃縮干燥后得到干品，均呈淺黃色粉末狀，易溶于甲醇。

2.3 93431菌株次級代謝產物4種組分的活性測定及毒性檢測結果 4種組分對MCF-7的抑制效果見表2。4種組分對MRC細胞的抑制效果見表3。由表2和表3可以看出，組分93431-2、93431-3和93431-4在100μg/mL濃度作用24 h時，對MRC細胞的抑制率分別為5.08%、12.47%和7.15%，顯示出較低的細胞毒活性，但遺憾的是這3種組分對MCF-7細胞的抑制作用也并不明顯，在同樣條件下，對MCF-7細胞的抑制率分別為6.02%、19.55%和6.9%。而組分93431-1對MCF-7細胞顯示出較強的抑制作用，在100μg/mL、作用24 h時，抑制率達到51.65%，而在同樣條件下，對MRC細胞的抑制率僅為17.54%。

另外，在加入93431-1(100μg/mL)作用24 h后，MCF-7在形態上發生了很大變化，細胞萎縮呈小球狀，細胞個數明顯減少，個別細胞出現細胞核固縮，而空白對照組細胞形態飽滿，有光澤，貼壁生長狀態良好。MRC細胞在加入93431-1后，倒置顯微鏡下觀察其形態與空白對照組相比并沒有發生太大變化。

表2 93431菌株代謝產物各組分對MCF-7細胞的抑制率(ˉx ±s)

表3 93431菌株代謝產物各組分對MRC細胞的抑制率(ˉx ±s)

3 討論

對于復發和轉移的乳腺癌，通常用藥物進行控制。但常用的化療藥物毒性很大，影響患者的生活質量。因此，研究和開發高效、低毒的抗乳腺癌藥物格外重要。

本研究對河北省微生物多樣性研究與應用實驗室保藏的黏細菌93431菌株進行活化、培養和發酵，進行次級代謝產物的提取、收集，并利用分析型高效液相色譜對活性菌株的發酵液提取物進行了各組分的分離、純化，利用MTT比色法篩選高效、低毒、有抗乳腺癌生物活性的物質。為活性組分的制備和結構測定以及為靶向抗乳腺癌藥物的開發和利用做準備。

利用分析型高效液相色譜對93431菌株發酵液中次級代謝產物的分離純化方法進行了系統的探索，確定了菌株93431代謝產物的洗脫條件，建立了適合菌株93431發酵液中活性產物的分析方法，即用 Thermo ODS-2、5 μm、250 mm ×4.6 mm 的色譜柱，選擇甲醇和水為流動相，設定流速為1 mL/min，進行80 min梯度洗脫，從菌株93431的發酵代謝產物中發現了多個組分。

利用制備型高效液相色譜，即用GRACE Allsphere ODS-2、5 μm、250 mm ×10 mm 的色譜柱，選擇甲醇∶水=72∶28為流動相，設定流速為4 mL/min，進行70 min等梯度洗脫，從菌株93431的發酵代謝產物中分析出4個組分，分別命名為93431-1、93431-2、93431-3、93431-4。

實驗發現，組分93431-1對乳腺癌MCF-7細胞有明顯的抑制作用，其濃度和其對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率之間存在較好的量效關系，隨著93431-1濃度的增長，對乳腺癌MCF-7細胞的抑制率也增大。但因為實驗所用樣品的最大濃度為100μg/mL，未能測得93431-1對乳腺癌MCF-7細胞的最大抑制率。有待對組分93431-1、93431-2、93431-3和93431-4分別進行配伍，并進一步提高組分93431-1的濃度，對乳腺癌MCF-7細胞的抑制作用做更完善的研究。

組分93431-1呈淺黃色粉末狀，有較強的極性，易溶于甲醇。采用MTT法以MCF-7、MRC細胞株作為實驗模型進行93431菌株代謝產物的活性及毒性測定，結果表明組分93431-1對MCF-7細胞抑制效果明顯，在藥物濃度為100μg/mL作用24 h的條件下，93431-1對MCF-7細胞的抑制率達到51.65%，且對MRC細胞毒性較小。對93431-1的結構測定及其抗癌活性的機理的研究正在進行之中。

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