Luminex液態芯片在臨床及科研中的應用

張保強 張曉

液態芯片是美國納斯達克上市公司Luminex于本世紀初研制出的后基因組時代的技術平臺，又稱懸浮陣列、流式熒光技術，是基于多功能流式點陣儀 （Luminex 100）開發的多功能生物芯片平臺，是一個多功能、多指標并行分析系統（見圖1）。它有機地整和了編碼微球（color-codedbeads）、激光技術、應用流體學、最新的高速數字信號處理器和計算機運算法則，造就了高度的檢測特異性和靈敏度，可廣泛應用于免疫分析、核酸研究、酶學分析、受體和配體識別分析等研究，也是目前唯一得到權威機構和醫學界共同認可用于臨床診斷的生物芯片平臺。2003年美國食品與藥品管理局(FDA)批準該項技術用于臨床檢驗診斷。

圖1 Luminex 100 多功能流式點陣儀

1 Luminex液態芯片技術的概況

1.1 工作原理

該技術的核心是采用聚苯乙烯(polystyrene)制作微球，把微小的聚苯乙烯小球（5.6 μm）包覆以不同比例的紅光及紅外光染色劑，制成100種不同顏色的微球[1]（見圖2）。將每種顏色的微球（或稱為熒光編碼微球）共價交聯上針對特定檢測物的探針、抗原或抗體。不同的微球結合了針對不同待檢測物的蛋白（抗體或抗原，用于免疫檢測）或核酸（DNA或RNA用于基因檢測），檢測抗體中以生物素標記，并用高靈敏的熒光染料染色。應用時，先把針對不同檢測物的編碼微球混合，再加入微量待檢樣本，在懸液中靶分子與微球表面交聯的分子進行特異性地結合，在一個反應孔內可以同時完成多達100種不同的生物學反應。

檢測時，使單個的微球通過檢測通道,并使用雙色激光同時對微球上的紅色分類熒光和報告分子上的綠色報告熒光進行檢測（見圖3）。紅色激光激發的是微球上的紅色分類熒光，根據微球的不同色彩編號，可以將微球分類，從而將各個不同的分析反應區分開來（見圖4）。綠色激光激發的是綠色報告熒光分子，目的是確定微球上結合的報告熒光分子的數量，從而確定微球上結合的目的分子的數量（見圖5）。因此，通過紅綠雙色激光的同時檢測，可以確定被結合的檢測物的種類和數量。再通過機器與計算機自動統計分析激光所檢測到微珠種類、數量，從而判定待測樣本多種目標測試物的濃度。因為分子雜交或免疫反應是在懸浮溶液中進行，檢測速度極快，而且可以在一個微量液態反應體系中同時檢測多達100個指標。

圖2 不同濃度的兩種顏色：紅色和紅外10種比例可以對100種微球進行編碼

圖3 利用紅綠雙色熒光對微求進行檢測

圖4 紅色激光激發微球的標碼熒光（定性）

圖5 綠色激光激發二抗標記的熒光（定量）

1.2 技術特點

Luminex液相芯片技術具有三大核心優勢：①高通量，一次操作可以檢測100個指標；②既能檢測蛋白，又能檢測核酸；③既能用于臨床，用能用于科研。此外，該技術還具有需樣本量少（檢測需樣本量僅為10μl）、高速度（最快可達10000測試/h）、靈敏度高（檢測低限為10pg/ml）、線性范圍廣（檢測范圍可達6個數量級）、重復性好、成本低、操作方便（見圖6）、數字信號、客觀可靠（見圖7）等優點。

圖6 Luminex 100?多功能流式點陣儀工作流程

圖7 標準曲線

2 Luminex液態芯片技術在臨床中的應用

2.1 腫瘤標志物檢測應用

腫瘤標志物檢測在腫瘤的早期診斷、療效檢測、預后評價、腫瘤復發的早期發現及高危人群的篩查等方面有著廣泛的應用。現常用的腫瘤標志物檢測方法有酶免疫分析法、時間分辨熒光法、化學發光法、電化學發光法、液態芯片法等。由于大部分單個標志物敏感性或特異性偏低，不能滿足臨床需要，近十年來，理論上和實踐上都提倡一次同時測定多個標志物。腫瘤標志物聯合應用可提高檢測的敏感性。多腫瘤標志物液態芯片定量檢測方法即是順應該要求,利用液態芯片的原理和特點建立的一種新型腫瘤標志物檢測方法。液態芯片技術檢測腫瘤標志物，在一次可檢測的指標數、標本用量、檢測速度、重復性、減少試劑成本、平臺通用性等方面，有其明顯的優勢。

2.2 自身免疫性抗體檢測的應用

自身抗體泛指機體免疫系統受某些內因、外因的作用對自身正常或變性的組織、器官、細胞、蛋白質或酶類等自身抗原成分產生免疫應答，由機體B淋巴細胞產生針對自身成分的抗體。自身抗體是自身免疫性疾病的重要標志，每種自身免疫性疾病都伴有特征性的自身抗體譜。病人血液中存在高效價自身抗體是自身免疫病的特點之一，也是臨床確診自身免疫性疾病的重要依據，對其進行綜合檢測分析在確診及預后評估具有重要意義。

常用的自身抗體檢測方法有微孔板ELISA法、免疫印跡法、酶免疫斑點（條帶）試驗等。傳統的檢測自身抗體的方法都存在手工操作、檢測費時、需樣本量大等缺點。近幾年發展起來的液態芯片技術采用在微球表面的雙抗夾心法檢測自身抗體，可多指標并行檢測，其檢測速度、自動化程度等均高于傳統方法。Rouquette 等利用液態芯片技術對九種抗核抗體（dsDNA,SSA,SSB,Sm,Sm/RNP,Scl-70,Jo-1,ribosome,and centromere B）進行檢測，此技術的靈敏度為99.1%，特異性達到100%。

目前，國際上有BMD、Bio－Rad Diagnostics、INOVA Diagnostics、ZEUS Scientific基于液態芯片平臺開發自身免疫疾病診斷方面的產品。其中2001年7月27日，INOVA公司的ENA系列液態芯片產品率先通過美國FDA認證，成為首個得到美國FDA認證的液態芯片產品。

2.3 移植配型的應用

臨床開展的HLA分型是針對等位基因A、B、DR三個位點六個抗原的分析。傳統的血清學分型法由于其特異性、分辨率等方面的不足，已經逐漸為分子生物學方法所替代，現HLA分型實驗室多采用PCR-SSP及PCR-SSO分型法。PCR/SSP方法用設計出的一整套等位基因組特異性引物，借助PCR技術獲得HLA型別特異的擴增產物，通過電泳直接分析帶型決定HLA型別，但不易自動化、不能檢測新的等位基因、試劑盒需不斷升級。Luminex液態芯片技術進行HLA分型，是把針對不同HLA等位基因特異性的探針與微珠結合，然后與擴增的DNA在一個實驗管里面進行雜交，以流式的原理進行檢測，這種技術在滿足有高通量、高靈敏度的同時，特異的探針技術能夠使得同一條鏈上的多態性位點建立一種關聯（即單倍型分析），進一步提高了分型的特異性。Luminex液態芯片技術的PCR-SSO分型法已經成為國家骨髓庫HLA分型的主要手段。

3 Luminex液態芯片技術在科研中的應用

3.1 Luminex XMAP液態芯片技術檢測人乳頭瘤病毒基因型

據世界衛生組織國際癌癥研究中心( International Agency for Research on Cancer, IARC)統計，宮頸癌是第二大女性惡性腫瘤。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌及其癌前病變發生發展的必要條，其亞型眾多，依其致病能力不同分為高危型和低危型。HPV檢測已成為宮頸癌篩查的重要方法之一，基因芯片技術檢測與分型同時進行，是目前HPV基因型研究的主要技術。上海透景生命科技有限公司研制的HPV DAN分型檢測液態芯片，可同時檢測26種HPV亞型，一次呈現，并具有以下優點：①明確分型，直接以亞型出具報告；②且反應靈敏度高，檢測低限僅為6-10拷貝；③雜交反應只需要15 min；④無需洗滌，操作簡便；⑤激光分析，數字信號，結果客觀、可靠；⑥可96孔板操作，適用于大規模篩查。

3.2 細胞因子檢測的應用

細胞因子(cytokine，CK)是由細胞（免疫細胞、非免疫細胞）合成、分泌的具有生物活性的低分子量蛋白質或多肽的統稱。細胞因子檢測在分子生物學基礎研究、揭示某些疾病的發生發展機制以及診斷和治療中具有重要的應用價值。對細胞因子水平進行全面監測與評價比監測單個細胞因子更具有臨床意義，但目前的檢測方法（分子生物學法、免疫法和生物學測定法）每次只能單一檢測一種細胞因子,且存在相互干擾、靈敏度不高、測定結果變異大、操作繁瑣、費時等問題。

應用液態芯片技術，可以檢測白細胞介素、干擾素、腫瘤壞死因子、集落刺激因子、趨化因子、生長因子等各種細胞因子。Tarnok等運用液態芯片技術檢測六種促炎性細胞因子(IL-1β、6、8、10、12、TNF-α)，用于新生兒膿毒血癥早期診斷。與傳統的檢測方法ELISA對比，二者的檢測結果具有良好的相關性，但液態芯片在孵育時間、標本用量、檢測線性范圍、檢測低限等方面均優于ELISA法，解決了傳統檢測方法費時、成本高及樣本采樣量大等缺點。Ray CA等在血漿中同時檢測5種細胞因子（IL-1-β,TNF-α,IL-6,IL-8,and IL-10），IL-8檢測最低限是100pg/ml，其它檢測最低限是20pg/ml，與ELISA相比，結果吻合度為84.5%，但比ELISA少用80%的樣本量，實驗更經濟。

3.3 在microRNA表達譜分析中的應用

MicroRNA是一種非編碼的短鏈RNA序列，它們在多種生物學過程中起著關鍵作用，部分腫瘤中已經發現了miRNA的表達異常，但miRNA的表達在腫瘤診斷中的價值尚未有過系統的研究。由于miRNA的序列很短（大約21bp），且不同序列家族之間的相似性非常高，現有方法用于miRNA研究時存在嚴重的交叉反應，因此需要一種準確、經濟的新方法。有研究利用液芯技術對334個包括多種人類腫瘤標本的217個哺乳動物miRNA的表達譜進行了系統研究，結果表明miRNA表達譜能夠反映腫瘤的組織來源和分化狀態，還發現腫瘤組織中的miRNA表達普遍下調。研究還發現，通過分析miRNA表達譜，可以成功地對分化程度很差的腫瘤進行分類，而mRNA的表達譜在應用于同一個樣本時的準確性極低。這些結果表明miRNA表達譜分析在腫瘤診斷中有著重要的應用價值。液態芯片技術用于microRNA表達譜分析，不但準確型高、特異性好，而且可以方便地用做常規檢查。

3.4 傳染病的診斷

目前，國外有報道通過將病原體的診斷抗原或變態反應原固定在微球表面上，實現對多種傳染性疾病如艾滋病（HIV）、麻疹、單純皰疹、流行性腮腺炎等進行快速診斷[2-3]。

液態芯片是較為理想的的臨床應用型生物芯片，是唯一得到美國FDA批準的芯片類技術[4]，也是唯一被納入美國臨床實驗室質控網絡的診斷芯片。作為近幾年來發展起來的新技術，液態芯片在腫瘤標志物檢測、自身抗體檢測、HLA分型、HPV基因分型、細胞因子、傳染病檢測等方面有了廣泛的應用。但此技術目前仍有不成熟之處，在縮小微球的球粒，使反應體系更接近液相環境；降低多指標檢測時不同抗體間或抗體與樣品蛋白之間可能存在的相互影響等方面還需要不斷改進。但可預見，液態芯片技術作為生物信息學先進的操作技術平臺,必將在臨床和科研各方面有著廣闊的應用前景。

[1]Biagini RE，Sammons DL，Smith JP，et a1.Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins[J].Clin Diagn Lab Immunol，2014, ll：50-55.

[2]Smlth P L，Walkerpeach C R，Fulton R J，et al.A rapid sensitive multiplexed assay for detection of viral nucleic acids using the FlowMetrix system[J].Clin Chem，1998，44(9)：2054-2056.

[3]Opalka DA，Bianchi E.Analysis of the HIV—A gp41 specific immune response using a multiplexed antibody detection assay[J].J Lmmtmol Methods，2004，287(1-2)：49-65.

[4]熙雄.免疫芯片[J].齊魯醫學檢驗，2005，16(6)：1-3.