SRAP與SSR分子標記在柳枝稷雜種鑒定中的比較分析

張婧，黃琳凱＊，ZHAO Bing－yu，張新全，嚴海東，蔣曉陽

（1.四川農業大學草業科學系，四川 雅安625014；2.弗吉尼亞理工大學，美國 弗吉尼亞州VA 24061）

柳枝稷 （Panicum virgatum）是一種高大的多年生草本C4植物，具有適應性廣、生物質產量高和對環境友好等優點，在生態改良和新能源開發方面潛力巨大［1］。開發清潔可再生的生物質能源意義深遠，美國能源部將柳枝稷作為纖維素類能源植物中的模式植物，而我國對柳枝稷的應用和研究尚處于起步階段，選育適合我國栽培的柳枝稷品種可加快能源植物產業的發展。

品種選育和改良可有效提高其能量轉化率和經濟效益，而分子育種可大大加快柳枝稷的育種進程。雜種鑒定是遺傳育種的基礎工作之一，鑒定出的真雜種可為雜交育種和遺傳圖譜構建等提供重要依據。柳枝稷是異花授粉多倍體植物［2］，在雜交過程中由于隔離不嚴或者具有一定的自交率等原因，不同來源花粉可導致種子生物學混雜，因此對雜交后代的真實性鑒定十分必要。分子標記技術由于具有快速簡便，可以實現高通量等優點，被廣泛應用于各種植物的雜種鑒定和雜種純度分析工作中，如柚（Citrus maxima）［3］，辣椒（Capsicum annuum）［4］，棗（Ziziphus jujuba）［5］等。其中簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記技術具有共顯性、結果可靠、重復性好的特點，在雜種鑒定，遺傳多樣性研究，遺傳圖譜構建等方面應用廣泛［6－9］。表達序列標簽（expressed sequence tags，ESTs）的發展促進了SSR的應用，并且快速增長的ESTs數據已成為SSR標記的重要開發來源。與基因組SSR相比，EST－SSR的開發不需要構建DNA文庫及克隆測序等步驟，更為節省成本和時間［10］。2001年美國加州大學 Li和 Quiros［11］發明了相關序列擴增多態性（sequence－related amplified polymorphism，SRAP）技術，是一種新型的基于PCR的隨機引物標記系統。SRAP屬于顯性標記，具有多態性高，操作簡便等優勢，已經被廣泛運用于遺傳多樣性分析和雜種鑒定工作中，如多花黑麥草（Lolium multiflorum）［12］、結縷草（Zoysia japonica）［13］、紫花苜蓿（Medicago sativa）［14］、柱花草（Stylosanthes guianensis）［15］等植物。但是這2種分子標記在柳枝稷雜種鑒定中的比較分析，尚未見報道。

本研究分別利用SRAP和SSR標記技術對柳枝稷165個雜交后代進行雜種真實性鑒定，分析顯性標記SRAP與共顯性標記SSR在雜種鑒定中的擴增多態性以及鑒定準確性和效率，為應用分子標記技術快速鑒定柳枝稷乃至異花授粉多倍體植物的雜種真實性提供依據，且鑒定得到的真雜種可以用于構建柳枝稷遺傳圖譜、重要性狀的QTL定位等研究。

1 材料與方法

1.1 供試材料

親本Alamo和Dacotah，以及以Alamo為父本，Dacotah為母本雜交得到的165株F1植株，編號為DAT1～DAT165。雜交后代和親本均盆栽于溫室中。其中Alamo屬于低地生態型，植株較高大，莖稈粗壯；Dacotah屬于高地生態型，莖稈較細，分枝較多。

1.2 基因組DNA提取

本實驗于2010年4月進行。以柳枝稷幼葉為材料，采用植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取DNA。提取的DNA用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳進行純度的檢測。將DNA樣品置于－20℃冰箱保存。待開始實驗時，將各個DNA樣品取出一部分稀釋至20ng／μL，放于4℃冰箱保存并備用。

1.3 SRAP分析

SRAP標記引物序列見Li和Quiros［11］的報道。SRAP標記共有上游引物12條，下游引物19條，兩兩組合為228對引物。用親本Alamo和Dacotah對SRAP引物進行父本特征帶的篩選。PCR擴增反應體系為20μL：DNA 2μL（20ng／μL），2×Taq PCR MasterMix（天根公司）10μL，上下游引物各1μL（10μmol／L），滅菌水補齊20μL。

SRAP－PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，35℃復性1min，72℃延伸1min，共5個循環；94℃變性1min，50℃復性1min，72℃延伸1min，共35個循環；最后72℃延伸10min，－20℃保存［16］。以上PCR反應在PTC－200PCR（Bio－Rad）儀上進行。最后PCR擴增產物采用2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，0.1mg／mL的溴化乙錠（EB）染色，120V電壓（5V／cm）在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5h，電泳結束后凝膠在凝膠成像系統（Bio－Rad）中照相并保存。

1.4 SSR分析

柳枝稷EST－SSR標記引物序列由Tobias等［17］提供，共30對引物。隨機選擇2個F1植株及雙親共4份材料的DNA對30對EST－SSR引物進行多態性篩選，選擇擴增條帶清晰、帶型穩定，具有父本特征帶的引物，用于雜種鑒定。PCR反應擴增體系20μL：DNA 2μL（20ng／μL），2×Taq PCR MasterMix（天根公司）10μL，上下游引物各1μL（10μmol／L），滅菌水補齊20μL。

EST－SSR PCR反應程序為：94℃預變性5min；94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸1.5min，共35個循環；最后72℃延伸10min，4℃保存。最后PCR擴增產物采用1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，0.1 mg／mL的溴化乙錠 （EB）染色，120V電壓（5V／cm）在0.5×TBE緩沖液中電泳約1.5h，電泳結束后凝膠在凝膠成像系統（Bio－Rad）中照相并保存。

1.5 雜種鑒定

對于顯性標記SRAP分子標記，F1擴增產物中具有父本特異條帶，則可鑒定為真雜種，若僅具有母本特異條帶，則需結合其他引物進行進一步分析；對于共顯性標記SSR分子標記，選取具有雙親互補型條帶的引物進行分析，F1擴增產物中具有父本特異條帶，則鑒定為真雜種，反之則為假雜種。

2 結果與分析

2.1 親本間具有多態性的SRAP引物篩選

對228對引物進行多態性條帶的篩選，選出在子代中多態性好，且具有父本特征帶的引物組合為：me1＋em7，me2＋em16，me2＋em5，me3＋em12，me7＋em13，me10＋em19，共6對。所選引物的多態性比率最大66.66%，最小為33.33%，平均為40.00%。

2.2 具有雙親互補帶型的EST－SSR引物篩選

從30對EST－SSR引物中，篩選出11對帶型穩定并在雜種及親本間具有多態性的引物（表1），這些多態性引物中，primer23，primer79，primer793和primer995具有雙親互補帶型，引物的多態性條帶比率為100.00%。所選引物多態性比率最小為50.00%，平均為71.22%。

表1 11對SSR引物多態性統計結果Table 1 The polymorphism of 11pairs of SSR primers

2.3 雜種真實性鑒定

在用SRAP引物鑒定過程中，引物me1＋em7有69個F1植株的擴增圖譜中沒有出現父本特征帶（表2），繼而使用其余引物逐一鑒定，只要出現父本特征帶則判定為真雜種，若僅有母本特征帶則利用其他引物進一步分析。實驗中共使用6對引物鑒定了165個F1植株的真實性，DAT163在所用引物中均未出現父本特征帶，不能確認是否為真雜種。引物me1＋em7的擴增圖譜見圖1。

在用EST－SSR引物鑒定過程中，僅使用1對引物，即primer23，就可以鑒別所有F1植株的真實性，體現了共顯性標記SSR在雜種鑒定中的高效性。但是應該選擇具有雙親互補性條帶進行雜種鑒定，如primer23，primer79，primer793和primer995，在父本Alamo中擴增帶型為ab，在母本Dacotah中擴增帶型為cd（primer23擴增效果見圖2）。鑒定結果為DAT163未出現父本特征帶，確認其為假雜種，與SRAP鑒定結果基本相同。

2.4 柳枝稷雜種群體的SRAP與SSR標記擴增產物多態性

利用6對SRAP引物對165個F1植株擴增，共得到20個條帶，平均每對引物得到3.3個條帶，其中多態性條帶共8條，平均每對引物1.3條多態性條帶，多態性條帶百分比為40%。因此SRAP在雜交種中檢測的多態性百分比相對較低（表2）。

用SSR引物primer23擴增時，得到4個條帶均為多態性條帶，屬于雙親互補型，多態性條帶比率為100%（表2）。表明SSR標記能夠檢測出較多的遺傳位點，獲得多態性高的PCR結果，鑒定效率更高。

圖1 引物me1＋em7對柳枝稷F1的SRAP檢測圖譜Fig.1 SRAP marker amplified with primer me1＋em7in the F1population

圖2 引物primer23對柳枝稷雜交種的SSR檢測圖譜Fig.2 SSR fingerprint amplified with primer pair No.primer23in switchgrass hybrids

3 討論

就準確性而言，SSR與SRAP標記的鑒定結果相同，都可用于柳枝稷的雜種鑒定工作，從而提高結果的準確性。但就鑒定效率而言，SSR分子標記表現出了很大的優勢。SRAP標記是一種顯性標記，在對雜種的真實性進行鑒定時，出現父本特異條帶就可以認為是真雜種，而出現母本特異條帶時則不能說明是否為真雜種。顯性標記只能肯定雜種的真實性，不能否定。同時，用多個引物才可以確定雜交種的真實與否。SSR是一種共顯性標記，本研究中只用1對ESTSSR引物便鑒定出了165個雜種的真實性，表現出了EST－SSR在雜種鑒定工作中的高效率。在研究中用了6對SRAP引物才鑒別出165個F1植株的雜種真實性，因此共顯性的EST－SSR標記在雜種鑒定工作中有獨特的優勢，但要選擇在親本中高度多態的引物，最好是在親本間能擴增出4個不同的條帶，如引物primer23。

表2 SSR標記與SRAP標記鑒定結果Table 2 Identification of 165hybrids by SSR and SRAP markers

本研究中，SRAP標記擴增條帶的多態性比率低于SSR標記。SSR多態性產生主要是由于DNA復制和修復過程中堿基的滑動、錯配或減數分裂過程中姊妹染色單體的不均等交換，故多態性產生的幾率較高［18］。SSR為共顯性遺傳，每個位點具有多個等位基因，因此SSR標記的期望異質性比顯性標記SRAP高。王華忠等［19］利用SRAP與SSR標記分析不同類型甜菜（Beta vulgaris）的遺傳多樣性證實了這一點，在他的研究中，11對SRAP引物共擴增出199個條帶，其中86條具有多態性，多態性帶比率為43.7%，而SSR的9對引物共產生35條擴增帶，多態性比率為100%，遠遠高于SRAP。

EST－SSR不僅具備傳統基因組SSR標記的優點，而且開發簡單快捷，費用更低；ESTs來自轉錄區，保守性高，故其通用性較好；此外EST－SSR可直接和表達基因相關聯，發現連鎖的分子標記之后，更容易克隆到目標基因［20］。作為一種新的SSR標記，EST－SSR標記已經在許多植物種類中得到應用，例如葡萄（Vitis vinifera）、甘蔗（Saccharum officinarum）、小麥（Triticum aestivum）以及高羊茅（Festuca arundinacea）等物種［10］，但在雜種鑒定中的應用報道較少。

目前報道的雜種鑒定研究多是基于單一分子標記鑒定的結果，本研究同時應用SSR和SRAP標記技術進行雜種鑒定，鑒定結果比單一標記鑒定的結果更準確、可靠，為應用分子標記技術快速鑒定柳枝稷乃至異花授粉多倍體植物的雜種真實性提供科學依據，且鑒定出的真雜種可用于柳枝稷遺傳圖譜的構建及重要性狀的QTL定位，從而為柳枝稷分子標記輔助育種的研究打下重要基礎。

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