氧化應激與總肺缺血再灌注細胞凋亡的相關性及川芎嗪干擾的影響

王曉楊 毛宇飛 王萬鐵 郝茂林 張 波

(金華職業技術學院醫學院病理生理教研室，浙江 金華 321000)

組織缺血再灌注(IR)時可觀察到細胞凋亡的發生〔1，2〕，并認為細胞凋亡可能是心臟IR損傷發生的重要機制之一〔3〕。川芎嗪(TMP)對大鼠IR視網膜氧化應激水平及細胞凋亡有重要的影響〔4〕。本課題探討肺IR損傷中氧化應激與細胞凋亡的關系，并探討川芎嗪對其的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 細胞凋亡試劑:原位末端標記試劑盒 (3%H2O2、Labelling緩沖液)、Tris鹽酸緩沖液(TBS)、封閉液生物素化抗地高辛抗體、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑等(武漢博士德公司提供)。川芎嗪注射液(批號03041711:山東長富潔凈藥業有限公司提供)。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒由南京建成生物工程公司提供。

1.1.2 動物 由溫州醫學院實驗動物中心提供健康清潔級日本大耳白兔60只，體重2.5～3.0 kg，雌、雄不拘。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及方法 隨機分為三組，每組30只:(1)假手術組。(2)IR組，再分三個亞組，每個亞組10只，開胸后左肺門阻斷1 h，分別開放接受1、3、5 h的再灌注，于缺血前60 min靜脈滴注與川芎嗪等量的生理鹽水。(3)川芎嗪干預組(TMP組)，于缺血前60 min靜脈滴注川芎嗪60 mg/kg，其余操作同IR組。

1.2.2 模型制備 經兔耳緣靜脈注射20%烏拉坦5 mg/kg，麻醉后仰臥位固定于手術臺。頸部正中切口，分離左頸外靜脈并插管，生理鹽水0.5～1.5 ml/min靜滴維持;左頸總動脈插管，接肝素化三通管;氣管切開插管，接動物呼吸機輔助呼吸，吸氧濃度100%，呼吸頻率30～40次/min，潮氣量雙側肺通氣15～20 ml/kg，單側8～10 ml/kg。沿胸骨左緣切斷第3、4、5肋骨開胸，離斷左側肺下韌帶，游離左肺門穿過阻斷帶備用，頸外靜脈注射肝素1 mg/kg抗凝。按Sekido等〔5〕報道的方法復制在體兔IR模型，即在呼氣末于左肺門處用阻斷帶結扎左側肺動脈、肺靜脈及左主支氣管，終止左肺血供為左肺缺血持續1 h;開放恢復供血和通氣為左肺再灌注。

1.2.3 血液指標測定 缺血1 h或術后1 h，再灌注1、3、5 h，從頸總動脈取血。3 500 r/min低溫離心15 min，取血清檢測下列指標:①血漿MDA含量:采用硫代巴比妥酸法，采用721分光光度計，在532 nm處比色測定。②血漿SOD活力:采用黃嘌呤氧化酶法，用721分光光度計在550 nm處比色測定。

1.2.4 標本的采集及處理 分別于再灌注1、3、5 h各時限點留取左肺標本，部分標本置于10%甲醛中固定，常規組織學處理、石蠟包埋切片;部分標本置液氮中，后放在-70℃冰箱中凍存待測。

1.2.5 觀察指標 肺細胞凋亡的檢測采用原位末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的dUTP缺口末端標記法(TUNEL)，按TUNEL檢測試劑盒的使用說明書進行。

1.2.6 判定標準 在光學顯微鏡下觀察TUNEL陽性細胞，細胞核染色呈棕黃色為陽性細胞，即為發生凋亡的細胞。

1.2.7 肺組織細胞凋亡分析 于各組切片中任意抽取其中一張切片，采用目測半定量法分析結果，凋亡指數計算方法〔6〕:在高倍視野(×400)下，選擇5個視野，分別計數凋亡細胞和總細胞數。計算細胞凋亡陽性個數，用細胞凋亡指數(AI)表示。AI=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%

1.3 統計學方法 應用SPSS11.0統計軟件進行分析，所有實驗數據均以±s表示，兩組之間比較用t檢驗，單因素方差分析用于多組均數顯著性檢驗。

2 結果

2.1 各組總血漿SOD活力比較 IR組的SOD活力在再灌注1、3、5 h與假手術組比較顯著降低(均P＜0.05)，TMP組在缺血1 h再灌注1、3、5 h SOD活力與IR組比較明顯升高(均P＜0.01)，且TMP組在再灌注1、3、5 h與假手術組比較SOD活力明顯升高(均P＜0.01)。見表1。

2.2 各組兔血漿MDA含量比較 在缺血1 h再灌注1、3、5 h，IR組與假手術組比較MDA含量顯著增高(P＜0.01);TMP組在缺血后再灌注1、3、5 h的MDA含量顯著高于假手術組(P＜0.05，P＜0.01)，但卻顯著低于 IR 組(P＜0.05，P＜0.01)。見表2。

2.3 肺組織細胞AI IR組及TMP組缺血后再灌注1、3、5 h均可見肺組織細胞凋亡現象，但TMP組再灌注同時相點的肺組織細胞凋亡數顯著減少(P＜0.01);兩組中3 h組凋亡細胞數均明顯高于1 h與5 h組(P＜0.01)。采用Pearson法進行相關性分析發現，AI與 MDA含量呈正相關(r=0.764，P＜0.05)，與SOD活力呈負相關(r=-0.665，P＜0.05)。見表3，圖1。

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

表1 兔血漿SOD活力(NU/ml，±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.05，2)P＜0.01;與IR組比較:3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組109.19±11.04 108.17±10.34 108.28±10.16 IR組 97.74.11±6.671) 99.30±11.281) 97.16±9.581)TMP組 112.15±7.92)3) 125.00±0.432)3) 120.13±7.992)3)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

表2 兔血漿MDA含量(nmol/ml，±s，n=10)

與假手術組比較:1)P＜0.01;與IR組比較:2)P＜0.05，3)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組1.61±0.34 1.76±0.38 1.72±0.23 IR組 4.20±0.641) 4.28±0.471) 4.28±0.831)TMP組 2.11±0.761)3) 2.24±0.721)2) 2.42±0.921)2)

表3 各組肺組織細胞AI指數比較(±s，n=10)

表3 各組肺組織細胞AI指數比較(±s，n=10)

與IR組比較:1)P＜0.01;與再灌注1 h和5 h組比較:2)P＜0.01

組別1 h 3 h 5 h假手術組0.60±0.74 0.61±0.64 0.62±0.72 IR組 14.9±1.911) 32.43 ±5.831)2) 18.72±2.251)TMP組 7.9±2.231)2) 22.40±3.021)2) 11.32±2.321)2)

圖1 各組光鏡下肺組織細胞凋亡情況(×400)

3 討論

細胞凋亡是在基因控制下的自主有序的細胞死亡，在維持細胞群體數量穩定及功能方面具有重要的作用，組織器官大量的細胞凋亡能夠引起該器官的功能明顯降低。本研究表明肺IR過程可引起肺細胞凋亡率顯著升高，與Fischer等〔7，8〕等研究結果一致。肺IR細胞凋亡與氧化應激具有一定的相關性。本實驗表明川芎嗪具有拮抗肺IR過程中細胞凋亡的作用，并且川芎嗪具有減輕肺IR損傷產生的氧自由基介導的脂質過氧化反應的作用。由自由基引發的脂質過氧化反應，導致生物膜上多聚不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應而引起生物膜結構的破壞。MDA是脂質過氧化反應的終產物，是反映脂質過氧化反應的指標，同時也是自由基損傷的指標〔9〕。自由基還可以直接導致蛋白質、核酸、多糖的結構和功能受損〔10〕，這可能是肺IR過程中導致細胞凋亡的主要機制之一。SOD為內源性的氧自由基清除機劑之一，催化超氧陰離子(O-2)轉化為H2O。氧化應激產物MDA與AI呈正相關，SOD可拮抗自由基的形成，抑制氧化應激反應，從而抑制減緩細胞凋亡的發生，故與AI呈負相關。該實驗表明川芎嗪可抑制氧化應激反應所致的自由基大量形成，從而減輕肺組織細胞凋亡，減輕由氧化應激導致細胞凋亡而引起的肺IR損傷。

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3 姚 震，焦解歌，馮建章，等 心肌缺血-再灌注損傷與細胞凋亡的關系實驗研究〔J〕.海南醫學院學報，2000;6(3):129-33.

4 施月歡，鄒秀蘭.川芎嗪對大鼠缺血再灌注視網膜SOD，MD和NO水平及細胞凋亡的影響〔J〕.中國實用眼科雜志，2002;20(1):25-7.

5 Sekido N，Mukaida N，Harada A，et al.Prevention of lung reperfusion injury in rabbits by a monoclonal antibody against in interleukin-8〔J〕.Nature，1993;365(6447):654-7.

6 段 紅，李 源，王鮮平，等.川芎嗪對缺血再灌注大鼠心肌細胞凋亡的影響〔J〕.武警醫學，2000;11(2):70-3.

7 Fischer S，Cassivi SD，Xavier AM，et al.Cell death in human lung transplantation:apoptosis induction in human lungs during ischemia and after transplantation〔J〕.Ann Surg，2000;231(3):424-31.

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10 林建東，廖秀玉，劉 寧，等.山莨菪堿防治急性肺損傷及機理的探討〔J〕.中國醫師雜志，2000;2(11):653-5.