C－反應蛋白基因多態性與腦梗死

鄧 可 肖志杰 黎肖弟

C-反應蛋白（C-reactive protein，CRP）是重要的急性期蛋白，作為經典的炎癥介質具有多種生理功能。炎癥在動脈粥樣硬化以及缺血事件的發生發展中起到重要的作用。數個前瞻性研究顯示，單獨測量血清CRP水平可作為首發和再發腦血管事件的危險預測因子［1～3］。國外的大量研究證實CRP與種族相關，目前國內尚無相關試驗報道，本研究對此進行了研究，采用病例－對照研究，探討rs1205基因多態性和缺血性腦卒中的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象 腦梗死組來源于2007年7月～2007年12月在中南大學湘雅二醫院神經內科急診室留觀或住院的中老年腦梗死患者105例，其中男75例，女30例；年齡37～92歲，平均年齡（64.1±11.4）歲；病程＜3 d；均符合全國第四屆腦血管病學術會議修訂的診斷標準，并經頭顱CT／MRI證實。根據美國國立衛生研究院卒中量表（NIHSS）評分，其中病情為輕度（NIHSS＜6）59例，中度（NIHSS6～13）36例，重度（NIHSS＞14）10例。體質量指數（BMI）24.12±6.40。伴有冠心病史30例，高血壓病史92例，糖尿病史25例；腦卒中家族史21例，吸煙史46例，飲酒史18例。對照組為121名同期門診體檢者，其中男73例，女48例；年齡45～80歲，平均年齡（62.5±9.2）歲；BMI 23.74±3.05。伴有冠心病史15例，高血壓病史28例，糖尿病史2例；腦卒中家族史2例，吸煙史16例，飲酒史8例。入組者排除伴隨腦出血、合并周圍血管疾病或周圍血管栓塞性疾病、大動脈炎、血液病、結核或明顯肺部感染、惡性腫瘤、嚴重肝腎功能不全者、曾接受器官移植者。腦梗死組和對照組在性別、年齡、BMI的差異無統計學意義（P＞0.05）。常見的危險因素如冠心病史、高血壓病史、糖尿病史、腦卒中家族史、吸煙史及飲酒史腦梗死組明顯高于對照組（P均＜0.05）。

1.2 血清h-s CRP水平測定 所有入選對象（腦梗死患者在發病24 h內，部分患者在發病的3 d內）采集清晨空腹靜脈血2 ml，由本院檢驗科用Hitachi 7170A全自動生化分析儀，采用免疫透射比濁法測定超敏 C－反應蛋白（high-sensitive C reactive protein，h-s CRP）水平。

1.3 CRP基因型測定 取肘靜脈血5 ml，采用低滲溶血、酚／氯仿法抽提外周白細胞基因組DNA，TE溶解保存；多聚合酶鏈式反應（PCR）和限制性片段長度多態性測定rs1205基因多態性，引物由博尚生物技術有限公司合成（表1）。

25μl PCR反應體系：10×PCR緩沖液2.5μl，Mg2＋25 mM1μl，4×dNTP25 nM1μl，上游和下游引物分別為10μM1μl，基因組DNA1μl，Taq酶5μ／μl 0.5μl，二甲基亞砜（DMSO）2.5μl。擴增條件：95℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸50 s，共35個循環，72℃延伸10 min，4℃保存。限制性內切酶消化反應體系20μl：PCR產物10μl，10×Buffer R2μl，內切酶2 U 酶切，37℃消化14 h。以pUC19DNA／MspI酶解片斷作為DNA片斷的標準物，20%聚丙烯酰胺凝膠電泳后銀染（圖1）。

圖1 rs1205產物酶解片段20%聚丙烯酰胺凝膠電泳譜

1.4 統計學處理 應用SPSS13.0軟件包。多數計量資料近似正態分布，而CRP呈偏態分布，將其對數轉換為Log CRP，經Kolmogorov-Smirnov檢驗近似正態分布（Z＝0.988，P＝0.283）再行檢驗。計量資料以均數±標準差（±S）表示，組間比較采用t檢驗；分類資料采用卡方檢驗；采用Logistic回歸模型判斷腦梗死危險因素作用的大小，分別計算各自的比值比（OR）及其95%可信區間（CI）。

2 結 果

2.1 腦梗死組與對照組基因型比較 在研究總人群（腦梗死組＋對照組）中rs1205基因型的頻率分別為CC17.7%，CT48.2%，TT34.1%；等位基因C／T的頻率分別為0.418和0.582，符合 Hardy－Weinberg平衡（χ2＝0.018，P＝0.894）。腦梗死組和對照組的基因型及等位基因的分布趨勢相同，差異無顯著性（P＞0.05）（表2）。

表2 腦梗死組與對照組rs1205基因型的比較

2.2 CRP基因型對CRP水平的影響 rs1205的CC、CT、TT基因型的Log CRP水平分別為（0.357±0.669）、（0.252±0.597）、（0.165±0.636）Log mg／L，基因型的血清Log CRP水平呈逐一下降趨勢，但差異無顯著性（P＞0.05）（表3）。

2.3 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響 在對腦梗死患者入院后立即用美國國立衛生院神經功能缺損評分（National Institues of Health Stroke Scale，NIHSS）將其分為3類：輕（NIHSS＜6）、中（6≤NIHSS≤13）及重（NIHSS≥14）。其中評分為重的h-s CRP和Log CRP水平均高于其他兩組，統計學有顯著性差異（P＜0.05）（表4）。

表3 CRP基因型對CRP的影響（±s）

表3 CRP基因型對CRP的影響（±s）

基因型 Log CRP（Log mg／L） P值rs1205 CC 0.357±0.669 0.309 CT 0.252±0.597 TT 0.165±0.636

表4 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響（±s）

表4 CRP水平對腦梗死嚴重程度的影響（±s）

注：與NIHSS輕、中組比較，＊P＜0.05

CRP水平 h-s CRP（mg／L）（中位數）Log CRP（Log mg／L）（images/BZ222.png±s）50中組（6≤NIHSS≤13）（n＝36） 4.06 0.52±0.67重組（NIHSS≥14）（n＝10） 28.99＊ 0.90±0.80輕組（NIHSS＜6）（n＝59） 2.91 0.43±0.＊

2.4 CRP基因型對腦梗死嚴重程度的影響 將腦梗死rs1205基因型與NIHSS評分制表如下，經χ2檢驗，rs1205基因型與腦梗死嚴重程度均無關聯，統計學無顯著性差異（P＞0.05）（表5）。

將三種基因型進行DNA序列測定。由測序圖譜可以看出，CRP1846C＞T的PCR擴增產物序列CC型中的堿基C（圖2－1中箭頭所指）突變為TT型中的T（圖2-3中箭頭所指），這與酶切結果一致（圖2）。

表5 CRP基因型×NIHSS交叉表

3 討 論

動脈粥樣硬化作為腦梗死的基因病因，越來越多的證據表明它是一個慢性炎性的過程。多個研究發現，年齡、性別、體重等多個臨床相關指標影響血清CRP 水平［4，5］。rs1205單核苷酸多態性是 CRP常見多態性之一，位于3′-UTR區域。rs1205對h-s CRP水平影響的研究結果大相徑庭［6，7］。本研究發現攜帶rs1205T等位基因的人群血清h-s CRP水平下降，但與CRP水平無顯著關聯。這可能與CRP的變化由多個因素影響，且遺傳影響較低［8］有關。

圖2 CRP1846C＞T PCR產物測序圖譜

rs1205在不同種族和地區的分布不同。通過對PUBMED SNP數據庫檢索獲得，rs1205T等位基因在歐洲人的分布頻率為0.333；在非洲人群中為0.150；在中國北京地區為0.556。在本研究中中國湖南漢族健康人群中rs1205單核苷酸多態性位點有CC、CT、TT三種基因型；T等位基因頻率分別為0.579。等位基因T的分布頻率明顯高于歐洲人群而與中國北京人群分布相似。由此可見T等位基因在不同種族的分布可存在差異。

許多研究都證實，CRP水平與缺血性腦卒中的發病相關［9，10］。而關于CRP基因多態性與缺血性腦卒中的關系卻存在爭議。Morita A等檢測了4個人類 CRP基因SNP基因型：rs1341665，rs1800947，rs1130864，rs1205后發現僅rs1800947與缺血性腦卒中有顯著關聯［11］。Kuhlenbaeumer G［12］等對4個SNPs（rs3093075，rs1205，rs1130864，rs1800947）研究發現，沒有相關的SNP位點或SNP單體型與整體的缺血性腦卒中相關，但三個單核苷酸多態性（rs3093075，rs1130864和rs1800947）與微血管閉室呈顯著的關聯。Wang Q等的研究沒有發現rs1205與缺血性腦卒中相關，但單體型H3與缺血性腦卒中相關。本研究沒有對腦卒中類型進行細分及構建單體型，研究發現重型腦梗死患者的hsCRP水平顯著高于輕、中度組，rs1205基因型與腦梗死及腦梗死病情的嚴重程度均無關，與之前的結果一致。

本研究采用病例－對照配比研究，標本量偏小；本研究沒有對腦卒中進行細分研究，研究結果與他人有差異，但可能與樣本選擇、種族差異等有關，有必要擴大樣本量、多地區間進行比較，以進一步探討。

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3 Di NM，Schwaninger M，Cappelli R，et al.Evaluation of C-reactive protein measurement for assessing the risk and prognosis in ischemic stroke：a statement for health care profesionals from the CRP Pooling Project members.Stroke，2005，36（6）：1316-1329.

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9 鄧 可，肖志杰，趙水平，等.血清超敏C-反應蛋白水平及CRP 1059G／C基因多態性與腦梗死的相關性.臨床神經病學雜志，2009，（6）：413-415.

10 Wang Q，Ding H，Tang JR，et al.C-reactive protein polymorphisms and genetic susceptibility to ischemic stroke and hemorrhagic stroke in the Chinese Han population.Acta Pharmacol Sin，2009，30（3）：291-298.

11 Morita A，Nakayama T，Soma M.Association study between C-reactive protein genes and ischemic stroke in Japanese subject.Am J Hypertens，2006，19（6）：593-560.

12 Kuhlenbaeumer G，Huge A，Berger K，et al.Genetic variants in the C-reactive protein gene are associated with microangiopathic ischemic stroke.Cerebrovase Dis，2010，30（5）：476-482.