腦出血后高血糖血腫周圍腦組織ATP與NO的關系研究

王小蓉 吳 勇 陳 婭 張瓊桂 李小剛

腦出血是臨床常見病和多發病之一。近年來從許多方面對其機制作了很多研究［1～3］。通過臨床觀察發現腦出血急性期合并血糖增高，加重腦損傷，影響預后。而高血糖導致腦損傷的原因尚不清楚。本實驗采用自體血注入法制作大鼠腦出血模型，通過監測大鼠血糖、血腫周圍腦組織ATP和NO含量，分析ICH后高血糖加重腦損傷的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠100只（購自瀘州醫學院實驗動物中心），重250～320 g，5～7月齡。

1.1.2 主要試劑 ATP試劑盒（由南京建成生物醫學工程研究所提供）；NO試劑盒（由南京建成生物醫學工程研究所提供）。

1.1.3 主要儀器 WDT-V型大鼠腦立體定位儀（西安光電儀器廠產品）；722光柵分光光度儀（上海第三分析儀器廠產品）；美國強生電子血糖儀。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 實驗動物隨機分為假手術組（SO，n＝25）；單純ICH 組（PCH，n＝25）；ICH后高血糖組，該組又分為2 g／kg（2G組）和4 g／kg（4G組）注射葡萄糖組（n均＝25）；參照 Xue、Yang的方法制備大鼠ICH模型［4，5］；SO組僅進行手術過程；PCH組注入自體不凝血50μl；高血糖組在注入自體血50μl后按2 g／kg和4 g／kg予以50%的高滲葡萄糖腹腔注射；分別在術后1、3、7、10、14 d終止觀察，取血腫周圍腦組織塊分別作腦組織ATP和NO含量測定。

1.2.2 血糖監測 臨手術的大鼠前一晚禁食，分別于術前、術后1、6 h取鼠尾血測血糖。

1.2.3 ATP含量測定 將取得的腦組織塊（1.5 mm×1.5 mm×1.5 mm）凍融后于0.4 mol／L HCIO4中制成10%的勻漿；低溫離心（－4℃，5 000 r／min，20 min），取上清液0.2 ml加3 mol／L K2CO30.1 ml中和 HClO4，漩渦振蕩2 min，高速離心（15 000 r／min，3 min），取50 ul上清液裝入 EP管備用，采用高效液相色譜法測定ATP含量。由瀘州醫學院附屬醫院檢驗科協作完成并計算。

1.2.4 NO含量測定 將取得的腦組織塊（1.0 mm×1.0mm×1.0mm）采用硝酸還原酶法測定。由瀘州醫學院附屬醫院檢驗科協作完成并計算。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 術后各組血糖水平變化（表1）

表1 各組不同時間點血糖水平變化（±s，mmol／L）

表1 各組不同時間點血糖水平變化（±s，mmol／L）

注：與SO組比較，＊P＜0.05；與PCH組比較，▲P＜0.05；與2G組比較，＃P＜0.05

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與SO組比較，腦出血3組血糖水平在術后1、6 h升高（P＜0.05）；與PCH組比較，2G和4G組明顯升高（P＜0.05），4G組明顯高于2G組（P＜0.05）。

2.2 術后各組血腫周圍腦組織NO含量變化（表2）

與SO組比較，腦出血3組血腫周圍腦組織NO含量，大鼠術后1 d開始升高，3 d升至最高（P＜0.05），7～10 d仍然具有統計學意義；與PCH組比較，2G和4G組明顯升高（P＜0.05），4G組明顯高于2G組（P＜0.05）。

2.3 術后各組血腫周圍腦組織ATP含量（表3）

與SO組比較，腦出血3組血腫周圍腦組織ATP含量，大鼠術后1 d開始降低，3 d降至最低（P＜0.05），7～10 d仍然具有統計學意義；與PCH組比較，2G和4G組降低（P＜0.05），4G含量組明顯低于2G組（P＜0.05）。

表2 術后血腫周圍組織NO含量（±s，umol／L）

表2 術后血腫周圍組織NO含量（±s，umol／L）

注：與SO組比較，＊P＜0.05；與PCH組比較，▲P＜0.05；與2G組比較，＃P＜0.05

組別 只數NO含量1 d 3 d 7 d 10 d 14d 29 PCH組 25 2.56±1.73＊ 2.86±1.68＊ 2.73±1.45＊ 2..52±1.56＊ 2.36±1.49＊2G組 25 2.76±1.33＊▲ 3.32±1.69＊▲ 2.98±1..78＊▲ 2.86.±1.46＊▲ 2.40±1.42＊▲4G組 25 2..92±1.46＊▲＃ 3.86±1.51＊▲＃ 3.32±1.65＊▲＃ 3.12±1.67＊▲＃ 2.52±1.47＊▲＃SO組 25 2.14±1.18. 2.10±1.30 2.22±1.20. 2.16±1.42 2.18±1.

表3 術后不同時間點血腫周圍組織ATP含量的變化（±s，μg／g）

表3 術后不同時間點血腫周圍組織ATP含量的變化（±s，μg／g）

注：與SO組比較，＊P＜0.05；與PCH組比較，▲P＜0.05；與2G組比較，＃P＜0.05

組別 只數ATP含量1 d 3 d 7 d 10 d 14d 32 PCH組 25 10.30±0.18＊ 7.08±0.09＊ 8.04±0.11＊ 9.03±0.04＊ 10.78±0.14＊2G組 25 9.77±0.10＊▲ 5.94±0.15＊▲ 6.26±0.15＊▲ 8.55±0.18＊▲ 10.22±0.13＊▲4G組 25 7.73±0.15＊▲＃ 3.44±0.14＊▲＃ 4.49±0.17＊▲＃ 7.93±0.13＊▲＃ 9.87±0.12＊▲＃SO組 25 11.45±0.28 11.30±0.17 11.48±0.24 11.16±0.22 11.20±0.

2.4 術后各組血腫周圍腦組織ATP含量與腦組織NO量相關性分析

ATP與腦組織NO含量：2G組（r＝－0.836，P＜0.05），4G組（r＝－0.889，P＜0.05），均呈負相關。

3 討 論

近年來腦卒中后血糖濃度的改變對腦組織的損傷以及對預后的影響也引起了人們的重視。研究資料顯示：ICH后高血糖可使病情加重，病死率和致殘率增高，預后差。腦出血后高血糖導致腦損傷的可能機制已經做了一些研究［6，7］。

本實驗發現，與SO組比較，腦出血3組血腫周圍腦組織ATP含量降低（P＜0.05）；與PCH組比較，2G組和4G組大鼠血腫周圍腦組織ATP含量明顯降低（P＜0.05），且4G組明顯低于2G組。說明ICH后高血糖可能加重腦組織能量代謝障礙，加重腦損傷，損傷的程度與血糖濃度有明顯的關系。

NO在體內扮演著生理和病理的雙重角色，腦內NO既可起腦保護作用，又可起神經細胞毒性作用。NO是由L-精氨酸在NO合酶（NOS）催化下生成的。生理量的NO可擴張血管，改善微循環及抗血小板凝聚等，但NO產生過多則會損害神經元，產生病理效應。本實驗通過檢測血腫周圍腦組織NO含量發現，與SO組比較，腦出血3組血腫周圍腦組織NO含量升高（P＜0.05）；與PCH組比較，2G組和4G組大鼠血腫周圍腦組織NO含量明顯升高（P＜0.05），且4G組明顯高于2G組。對血腫周圍腦組織NO與ATP含量進行相關性分析發現二者呈負相關，腦出血后高血糖致能量代謝障礙越重，腦組織產生一氧化氮越多，腦損傷越重。分析原因可能為（1）NO通過作用于鐵蛋白產生毒性結合ADP－核糖化轉移酶，使ADP糖基化，作用于鐵－硫蛋白類如輔酶Q氧化還原酶、輔酶Ⅰ、琥珀酸氧化還原酶等酶系統，使細胞呼吸抑制和能量代謝障礙，導致腦損傷加重；且與血紅素結合的鐵蛋白如運鐵素和核糖核苷酸還原酶作用，NO促進運鐵素釋放鐵，游離鐵可促進脂質過氧化而加重能量代謝障礙，進一步加重腦損傷；（2）NO與超氧自由基〔O2－〕結合可產生硝基過氧化物，引起較大的毒性，加重能量代謝障礙，加重腦損傷；（3）NO可以通過堿基的脫氨基作用導致DNA損傷，同時也直接使DNA斷裂，加重能量代謝障礙，從而加重腦損傷。

1 方 煌，梅元武，李朝武，等.實驗性腦出血灶周 MMP-9的表達與腦水腫的關系.卒中與神經疾病，2009，16（4）：214-217.

2 孟慶偉，郭景紅，吳家冪.血紅素氧合酶-1在大鼠實驗性腦出血中的作用機制.卒中與神經疾病，2008，15（6）：334-336.

3 Aoki E，Yano R，Yokoyama H，et a1.Role of nuclear transcription factor kappa B（NF-kappa B）for MPTP（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahyropyridine）-induced apoptosis in nigral neurons of mice.Experimental and Molecular Pathology，2009，86（10）：57-64.

4 Xue M，Del Bigio MR.Intracerebral injection of autologous whole blood in rats：time course of inflammation and cell death.Neurosci Lett，2000，283（3）：230-232.

5 Yang GY，Betz AL，Chenevert TL，et a1 Experimental intracerebral hemorrhage：relationship between brain edema，blood flow and blood-brain barrier permeability in rats.J Neurosurg，1994，81（1）：93-102.

6 王小蓉，何曉英，李小剛.實驗性腦出血高血糖與血腫周圍乳酸和細胞因子關系的研究.中風與神經疾病雜志，2010，27（4）：357-359.

7 王小蓉，譚 華，彭紹忠等.大鼠腦出血后高血糖對腦損傷的實驗性研究.陜西醫學雜志，2009，38（4）：405-408.