響應(yīng)面分析法優(yōu)化1-脫氧野尻霉素液相色譜檢測(cè)的衍生化條件

王 騰，李 樾，李翠清，*，張亞運(yùn)，李繼文，郭曉燕

（1.北京石油化工學(xué)院制藥工程系，北京 102617；

2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

響應(yīng)面分析法優(yōu)化1-脫氧野尻霉素液相色譜檢測(cè)的衍生化條件

王 騰1，李 樾2，李翠清1，*，張亞運(yùn)1，李繼文1，郭曉燕1

（1.北京石油化工學(xué)院制藥工程系，北京 102617；

2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

在1-脫氧野尻霉素的高效液相色譜法分析中，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了熒光衍生化的最佳條件。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以1-脫氧野尻霉素回收率為響應(yīng)值，應(yīng)用響應(yīng)面分析法研究衍生化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和衍生化試劑用量各因素間的交互作用及對(duì)1-脫氧野尻霉素回收率的影響。確定最佳衍生化條件為：衍生化反應(yīng)時(shí)間22min、衍生化反應(yīng)溫度29℃、衍生化試劑用量0.43mmol/L，實(shí)際回收率為99.4%。

1-脫氧野尻霉素，衍生化，響應(yīng)面分析法，高效液相色譜

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，1-DNJ）是一種哌啶類生物堿，化學(xué)名稱3，4，5-三羥基-2-羥甲基四氫吡啶，分子式為C6H13NO4。1-DNJ是桑葉中特有的生物堿，是其主要的活性成分之一?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，1-DNJ為α-糖苷酶抑制劑，能有效地降低餐后的血糖濃度，起到預(yù)防和治療糖尿病的效果，在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-3]。1-DNJ分子結(jié)構(gòu)中無(wú)苯環(huán)、雙鍵、羰基等發(fā)色基團(tuán)，給其定性定量分析帶來(lái)了一定的困難，目前已報(bào)道的分析方法有高效液相色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)法或高效液相色譜-柱前衍生化法[4-8]。其中，衍生化法因其簡(jiǎn)便快速，靈敏準(zhǔn)確，操作簡(jiǎn)單且衍生化產(chǎn)物相對(duì)穩(wěn)定而成為常用的方法之一。本文采用熒光試劑芴甲氧羰酰氯（9-fluorenyl-methyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）與1-DNJ進(jìn)行柱前衍生化，以高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行分離測(cè)定。重點(diǎn)對(duì)衍生化反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化篩選，考察衍生化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和衍生化試劑用量對(duì)1-DNJ回收率的影響，應(yīng)用響應(yīng)面分析法優(yōu)化衍生化條件，以期建立更為可靠、穩(wěn)定及靈敏的1-DNJ定量檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-脫氧野尻霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥99.0%） 上海同田生物技術(shù)有限公司；芴甲氧羰酰氯（純度≥99.0%） 美國(guó)ALDRICH公司；色譜乙腈、甘氨酸、四硼酸鉀 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；冰醋酸 北京化工廠；實(shí)驗(yàn)用水 為娃哈哈純凈水；其他試劑 均為分析純。

Waters2695高效液相色譜系統(tǒng)配有Waters2475熒光檢測(cè)器和Empower操作系統(tǒng) 美國(guó)Waters公司；pHS-25數(shù)顯酸度計(jì) 中國(guó)上海精密科學(xué)儀器有限公司；AL204-IC分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)；電子數(shù)字恒溫儀 中國(guó)金壇恒豐儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 衍生化反應(yīng) 取一定濃度的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL置于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH8.5）20μL及一定濃度的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于一定溫度下恒溫反應(yīng)一定時(shí)間后，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完全。最后加入0.1%（V/V）的醋酸水溶液1.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后，取10μL進(jìn)行色譜分析[8]。

1.2.2 高效液相色譜條件 色譜柱：Kromasil C18分析柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸（50∶50，V∶V）；流速：1.0mL/min；柱溫：35℃；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)254nm，發(fā)射波長(zhǎng)322nm；進(jìn)樣體積：10μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品10mg，精密稱定，置于10mL容量瓶中，加純凈水適量使其溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得到濃度為1.0mg/mL的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。分別精密量取上述儲(chǔ)備液10、20、50、100、250、500μL，置10mL容量瓶中，分別加流動(dòng)相稀釋至刻度，得到濃度為1、2、5、10、25、50mg/L的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液，衍生化后進(jìn)行色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 衍生化反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 以已知濃度的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液為研究對(duì)象，在1-DNJ衍生化過(guò)程中，以1-DNJ回收率為指標(biāo)，考察衍生化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和衍生化試劑用量對(duì)衍生化反應(yīng)的影響，1-DNJ回收率計(jì)算方法見(jiàn)式（1）。

1.2.4.1 衍生化反應(yīng)時(shí)間的影響 取50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH8.5）20μL及0.4mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于30℃水浴中反應(yīng)不同時(shí)間（15、20、25、30、35min），加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.4.2 衍生化反應(yīng)溫度的影響 取50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH8.5）20μL及0.4mmol/L的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于不同溫度（20、25、30、35、40℃）的水浴中反應(yīng)20min，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.4.3 衍生化試劑用量的影響 取50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液20μL于1.5mL的離心管中，加入0.4mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH8.5）20μL及不同濃度的（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mmol/L）的FMOC-Cl的乙腈溶液40μL，振蕩混勻，于30℃水浴中反應(yīng)20min，加入1mol/L的甘氨酸溶液20μL，靜置5min，讓多余的衍生化試劑反應(yīng)完全。最后加入0.1%（V∶V）的醋酸水溶液1.0mL，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過(guò)后取10μL進(jìn)行色譜分析。

1.2.5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理優(yōu)化衍生化條件，衍生化反應(yīng)條件及因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels for response surface analysis

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Design Expert軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析[9-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線

不同質(zhì)量濃度的1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)高效液相色譜分析，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）為橫坐標(biāo)，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，線性方程為：Y=558867X-4671，R2=0.9994。結(jié)果表明，1-DNJ質(zhì)量濃度在1～50mg/L的范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖1 1-DNJ標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of 1-DNJ

2.2 衍生化反應(yīng)單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 衍生化反應(yīng)時(shí)間的影響 在衍生化反應(yīng)溫度30℃，F(xiàn)MOC-Cl濃度0.4mmol/L條件下，考察衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)1-DNJ回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 衍生化反應(yīng)時(shí)間對(duì)1-DNJ回收率的影響Fig.2 Effect of derivative time on the recovery of 1-DNJ

由圖2可見(jiàn)，當(dāng)衍生化反應(yīng)時(shí)間為15～35min時(shí)，1-DNJ的回收率均可達(dá)到85%以上。當(dāng)衍生化反應(yīng)時(shí)間超過(guò)20min時(shí)，1-DNJ的回收率隨反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)而下降，可能的原因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，部分衍生化反應(yīng)產(chǎn)物分解造成了回收率的損失。因此，合適的衍生化反應(yīng)時(shí)間應(yīng)該在20min左右。

2.2.2 衍生化反應(yīng)溫度的影響 在衍生化反應(yīng)時(shí)間20min，F(xiàn)MOC-Cl濃度0.4mmol/L條件下，考察衍生化反應(yīng)溫度對(duì)1-DNJ回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 衍生化反應(yīng)溫度對(duì)1-DNJ回收率的影響Fig.3 Effect of derivative temperature on the recovery of 1-DNJ

由圖3可知，衍生化反應(yīng)溫度在20～30℃范圍內(nèi)，1-DNJ回收率隨溫度的升高而增大，當(dāng)溫度超過(guò)30℃時(shí)，回收率呈下降趨勢(shì)。結(jié)果說(shuō)明衍生化溫度過(guò)低，衍生化反應(yīng)不完全，溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致衍生化產(chǎn)物不穩(wěn)定而使回收率下降。因此，初步確定衍生化反應(yīng)的適宜溫度約在30℃左右。

2.2.3 衍生化試劑用量的影響 在衍生化反應(yīng)時(shí)間20min，衍生化反應(yīng)溫度30℃條件下，考察衍生化試劑用量對(duì)1-DNJ回收率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 衍生化試劑用量對(duì)回收率的影響Fig.4 Effect of derivatization reagent amount on the recovery of 1-DNJ

圖4表明，隨著衍生化試劑用量的增加，1-DNJ回收率呈逐漸遞增的趨勢(shì)。在衍生化試劑加入量固定為40μL的條件下，當(dāng)FMOC-Cl濃度超過(guò)0.5mmol/L，衍生化試劑即已過(guò)量。因此，初步確定適宜的衍生化試劑濃度為0.4mmol/L左右。

2.3 響應(yīng)面分析法優(yōu)化衍生化反應(yīng)條件

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用三因素水平響應(yīng)面分析法優(yōu)化衍生化條件。以隨機(jī)次序設(shè)計(jì)進(jìn)行了17組實(shí)驗(yàn)，其中3組區(qū)域的中心點(diǎn)（3個(gè)零點(diǎn)）重復(fù)實(shí)驗(yàn)，用以估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差，響應(yīng)面分析方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用Design Expert軟件對(duì)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到關(guān)于衍生化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和衍生化試劑用量的模型，回歸方程為：Y=97.63+2.59X1+1.27X2+1.33X3-0.56X1X2+1.73X1X3+3.83X2X3-10.87X12-5.20X22-3.33X32，回歸方程的方差分析如表3所示。

從方程的方差分析可見(jiàn)，模型p值小于0.01，表明實(shí)驗(yàn)選用的模型極顯著。模型失擬項(xiàng)p＝0.1162＞0.05，表明失擬項(xiàng)相對(duì)于絕對(duì)誤差不顯著，模型選擇合適，模型可靠。回歸方程相關(guān)系數(shù)R2=0.9417，說(shuō)明回收率實(shí)際值與預(yù)測(cè)值之間具有較好的擬合度，方程可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系，僅有約5%的變異不能由該模型解釋。

表2 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Experiments design and results for response surface analysis

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the regression model

回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表4。由表4可知，3個(gè)因素的p值相差較大，其中一次項(xiàng)衍生化反應(yīng)時(shí)間（X1）、衍生化反應(yīng)溫度與衍生化試劑用量（X2X3）和二次項(xiàng)衍生化試劑用量（X32）的方程回歸系數(shù)達(dá)到差異顯著水平，二次項(xiàng)衍生化反應(yīng)時(shí)間（X12）和衍生化反應(yīng)溫度（X22）的方程回歸系數(shù)達(dá)到差異極顯著水平。各因素對(duì)1-DNJ回收率影響大小的順序?yàn)椋貉苌磻?yīng)時(shí)間（X1）＞衍生化試劑用量（X3）＞衍生化反應(yīng)溫度（X2）。

表4 回歸方程系數(shù)顯著性差異Table 4 Significance test of regression equation coefficients for the regression model

2.4 衍生化條件的響應(yīng)面分析

為分析任意兩因素交互作用的影響，固定任一因素為零水平，考察另兩個(gè)因素的交互作用即得響應(yīng)面圖如圖5所示，響應(yīng)曲面陡表示交互作用顯著，響應(yīng)面緩則不顯著[12-13]。由圖5可知，衍生化反應(yīng)溫度與衍生化試劑用量有著顯著的交互作用；而衍生化反應(yīng)時(shí)間與衍生化反應(yīng)溫度、衍生化反應(yīng)時(shí)間與衍生化試劑用量的交互作用不顯著。

圖5 各因素交互作用對(duì)1-DNJ回收率影響的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plots for the effect of cross-interaction on the recovery of 1-DNJ

2.5 響應(yīng)面分析結(jié)果驗(yàn)證

采用Design Expert軟件進(jìn)行參數(shù)最佳化分析，得到1-DNJ衍生化反應(yīng)的最佳條件為：衍生化反應(yīng)時(shí)間22.3min、衍生化反應(yīng)溫度28.6℃、衍生化試劑濃度0.43mmol/L，對(duì)應(yīng)的1-DNJ理論回收率為99.6%。為檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，以衍生化反應(yīng)時(shí)間22min、衍生化反應(yīng)溫度29℃、衍生化試劑濃度0.43mmol/L進(jìn)行衍生化反應(yīng)實(shí)驗(yàn)，平行5次實(shí)驗(yàn)的1-DNJ實(shí)際回收率為99.4%。實(shí)測(cè)值與理論值無(wú)顯著性差異，說(shuō)明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化的1-DNJ衍生化條件是可靠的。

3 結(jié)論

本文采用單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了衍生化反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度和衍生化試劑用量對(duì)1-DNJ回收率的影響，并在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了衍生化條件。建立了衍生化條件與1-DNJ回收率關(guān)系的回收模型，經(jīng)方差分析證明模型合理可靠，能夠較好的預(yù)測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。利用模型的響應(yīng)面，對(duì)影響因素及相互作用進(jìn)行了探討。響應(yīng)面分析得到的最佳衍生化條件為：衍生化反應(yīng)時(shí)間22min、衍生化反應(yīng)溫度29℃、衍生化試劑濃度0.43mmol/L，實(shí)際回收率為99.4%，1-DNJ回收率與理論值無(wú)顯著差異，表明采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化1-DNJ的衍生化條件準(zhǔn)確可靠，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。

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Optimization of derivatization conditions for the determination of 1-deoxynojirimycin by response surface methodology

WANG Teng1，LI Yue2，LI Cui-qing1，*，ZHANG Ya-yun1，LI Ji-wen1，GUO Xiao-yan1
（1.Department of Pharmaceutical Engineering，Beijing Institute of Petro-chemical Technology，Beijing 102617，China；2.National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China）

For the purpose ofestablishing ahighperformanceliquid chromatographymethod forthe determination of 1-deoxynojirimycin（1-DNJ），the optimal derivatization conditions were studied by response surface methodology.Based on the result of single factor experiments，the Box-Behnken design was used to investigate the effect of derivative time，temperature and the amount of derivative reagent on the recovery of 1-deoxynojirimycin.The derivative conditions were found to be 22min，29℃ and 0.43mmol/L and the recovery was 99.4%.

1-deoxynojirimycin；derivatization；response surface methodology；HPLC

R284.1

A

1002-0306（2012）22-0063-05

2012－08－23 * 通訊聯(lián)系人

王騰（1978－），男，講師，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。

教育部科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目（211003）；北京市教育委員會(huì)科技發(fā)展計(jì)劃面上項(xiàng)目（KM201110017002）。