響應面法優化膠質芽孢桿菌GM 1增殖發酵培養基

李東華，楊 博

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）

響應面法優化膠質芽孢桿菌GM 1增殖發酵培養基

李東華，楊 博*

（華南理工大學生物科學與工程學院，廣東廣州 510006）

在搖瓶培養條件下，優化提高膠質芽孢桿菌GM1菌體濃度的發酵培養基組分。在單因素的基礎上選擇糖蜜、復合氮源（硫酸氨與豆粕）以及初始pH為自變量，芽孢桿菌數為響應值，根據Box-Behnken實驗設計原理以及Design Expert 8.0軟件進行回歸分析，確定了膠質芽孢桿菌GM1發酵培養基的最佳組成為：糖蜜3.2%、復合氮源0.4%，pH為8.0，在此條件下最大理論數值為3.03×108CFU·mL-1。經過3次平行實驗驗證，實際活菌體數為3.09×108CFU·mL-1，該實驗值與預測值擬合較好。優化后的活菌濃度與優化前菌體濃度相比提高了40%，由此可知，響應面分析法優化微生物發酵條件是一種十分有效的方法。

膠質芽孢桿菌，響應面法，菌體密度，優化

膠質芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）是一種能分解硅酸鹽礦物的細菌，國內一些學者也把它稱為硅酸鹽細菌[1]。除此之外膠質芽孢桿菌還具有解磷、解鉀、固氮的作用，它不僅可以提高土壤中可溶性磷和鉀的含量，而且還有促進植物生長、提高植物抗病性，以及改善土壤結構等作用，是良好的微生態肥料生產菌種[2-3]，所以最近幾年來對膠質芽孢桿菌在生物肥料領域中的應用研究越來越多。中國鉀肥資源嚴重不足[4]，國家每年需大量進口無機鉀肥。開發利用微生態鉀、磷肥不僅可以帶來較好的經濟效益，也能維護生態平衡。因此，對于工業化生產來說，如何降低投入成本、采用價格低廉且來源豐富的原材料作為膠質芽孢桿菌培養基具有重要的意義。本研究以前期實驗為基礎，采用單因素實驗和響應面法[5-6]對發酵培養基組分進行了優化，這對有效地利用和促進菌株的生長具有重要的現實意義，可為生物菌肥的研制提供必要的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膠質芽孢桿菌（Bacillusmucilaginosus）GM1 由華南理工大學生物科學與工程學院篩選保存；斜面培養基 膠凍樣芽孢桿菌瓊脂培養基[7]；種子液 蔗糖5g/L、NaHPO42g/L、MgSO40.5g/L、CaCO30.1g/L、FeCl35mg/L、pH 7.5～8.5，蒸餾水體積1000m L；單因素實驗培養基 糖蜜1%～5%、復合氮源（硫酸氨∶豆粕=2∶1）0.2%～0.5%、K2HPO42g/L、MgSO41g/L、CaCO31g/L、FeCl35mg/L、pH7.5，蒸餾水體積1000m L。

PHS-3C型手持式pH計 上海偉業儀器廠；CP2245型電子天平感量0.0001g 德國Sartorius公司；DSHZ－300A型全溫生化培養箱 太倉市實驗設備公司；HJ-VD-650型超凈工作臺（SW-CJ） 上海凈化；YXQ-SG46-280S型壓力蒸汽滅菌鍋 上海博迅；Labnet P3960型系列移液槍 美國。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 斜面菌種34℃活化24h后接種一環至種子培養液（裝液量50m L/250m L錐形瓶），34℃培養42h后以5%的接種量接入單因子實驗及Box-Behnken實驗培養基（50m L/250m L錐形瓶），34℃、200r/min培養42h。

1.2.2 活菌數的測定 活菌數的測定采用平板稀釋法。

1.2.3 單因素實驗 a.糖蜜濃度對活菌數的影響。目前研究[10]表明，糖蜜等復合碳源比其他碳源更有利于菌體的增殖。分別選擇糖蜜濃度為1%、2%、3%、4%、5%，其他成分不變，搖瓶培養42h，觀察活菌數的變化，以確定最佳糖蜜濃度。b.復合氮源（硫酸氨∶豆粕=2∶1）濃度對活菌數的影響。復合氮源更有利于菌體的增殖，且復合氮源中有機和無機氮源的添加比例是一個重要的影響因素[11]。分別選擇氮源濃度為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，其他成分不變，搖瓶培養42h，觀察活菌數的變化以確定最佳氮源濃度。c.氮源比例（硫酸氨∶豆粕）對活菌數的影響。分別選擇氮源比例[8]為1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1、3.5∶1、4.0∶1，氮源濃度為0.4%，其他成分不變，搖瓶培養42h，觀察活菌數的變化以確定最佳氮源比例。d.初始pH對活菌數的影響。pH通過影響細胞膜的通透性、膜結構的穩定性以及酶促反應的穩定性等，從而影響微生物的生長速率[9]。分別調培養基初始pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，搖瓶培養42h，觀察活菌數的變化以確定最佳pH。

1.2.4 響應面設計 根據單因素實驗結果和Box-Behnken設計原理，選取對活菌數有較大影響的3個因素進行3因素3水平的響應面分析實驗，因素水平編碼見表1，并且利用統計分析軟件Design-Expert 8.0進行實驗設計和數據分析，以確定各因素對活菌數影響的顯著性和發酵條件的最優組合。

表1 因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 最佳糖蜜濃度的確定 由圖1可知，當糖蜜濃度較低時，GM1活菌數隨著糖蜜濃度的增大而增大，當糖蜜濃度為3%時活菌數達到最大值，之后隨著糖蜜濃度的增大，活菌數略有下降。因此確定糖蜜最佳濃度為3%。且從作者以前做過的實驗中可知，糖蜜濃度越高，發酵后pH越低，很有可能抑制GM 1的生長。

圖1 糖蜜濃度對菌體密度的影響Fig.1 Influence of themolasses on the spore production ofGM1

2.1.2 最佳復合氮源濃度的確定 由圖2可知，隨著復合氮源濃度的增加，GM 1活菌數呈先上升后下降的趨勢，當復合氮源濃度為0.4%時活菌數達到最大值，之后隨著復合氮源濃度的增大，活菌數呈下降趨勢。因此，確定復合氮源最佳濃度為0.4%。無機氮源比有機氮源更易被菌體直接吸收利用，促進菌體增殖，這可能是因為銨鹽中的氮與細胞中的氮處于相同的氧化水平[9]，而添加豆粕粉會在生長后期作為遲效氮源對菌體增殖產生明顯的促進作用[10]。

圖2 復合氮源濃度對菌體密度的影響Fig.2 Influence of the complex nitride on the spore production of GM1

2.1.3 最佳氮源比例的確定 由圖3可知，隨著無機氮與有機氮比例的增加，菌體密度逐漸增加，當比例為2∶1時，菌體密度達到最大值，說明此氮源比例的培養基最適宜微生物生長繁殖，這可能是因為菌體生長初期，其酶系還未建立完全，無機氮源更有利于菌體吸收利用；而當菌體酶系建立完善后，則分解并利用營養更為豐富的有機氮源[11]。

圖3 氮源比例對菌體密度的影響Fig.3 Influence of complex nitride ratio on the spore production of GM1

2.1.4 最佳pH的確定 微生物生長過程中機體內發生的絕大多數的反應是酶促反應，而酶促反應都有一個最適pH范圍，在此范圍內只要條件適合，酶促反應速率最高，微生物生長速率最大。pH通過影響細胞膜的透性、膜結構的穩定性和物質的溶解性或電離性來影響營養物質的吸收，從而影響微生物的生長速率[9]。由圖4可知，起始pH對細菌的生長有明顯影響，隨著pH的增加，GM 1活菌數也呈先升高后降低的趨勢，在pH8.0時菌數達到最大值，故確定8.0作為最佳pH。實驗表明偏堿性的條件更有利于膠質芽孢桿菌的生長繁殖。

圖4 初始pH對菌體密度的影響Fig.4 Influence of pH value o on the spore production of GM1

2.2 響應面實驗

依據單因素實驗結果，選取糖蜜、復合氮源和初始pH三因素進行響應面法Box-Behnken模型實驗設計，實驗設計與數據分析見表2。

表2 響應面實驗設計及結果Table 2 Results of response surface experiments

利用Design Expert 8.0軟件對表2實驗數據進行回歸分析，得二次多元回歸模型為：Y=3.00+0.0862X1+ 0.094X2-0.15X3+0.19X1X2+7.500E-003X1X3-0.038X2X3-0.21X12-0.97X22-0.39X32對所得模型進行方差分析，結果見表3。

由表3知，二次多項模型具有高度的顯著性（pmodel＜0.0001），說明二次回歸模型是顯著的，失擬項p=0.3190＞0.05，沒有顯著意義，不必引入更高次項，模型適當，相關系數R2=0.9883，表明發酵GM 1活菌數的實測值與預測值之間具有較好的擬合度，可以應用于膠質芽孢桿菌發酵的理論預測。

初始pH的一次項和二次項，糖蜜濃度和復合氮源濃度的二次項對GM 1活菌數的影響達到極顯著水平（p＜0.01）。各因素對活菌數量的影響順序為：X22＞X32＞X12＞X3。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

2.3 各因素之間的交互作用

根據回歸方程在考察的區域內利用Design Expert 8.0軟件對以上3個因素繪制響應面圖及等高線圖（圖5～圖7），各圖表示糖蜜濃度、復合氮源濃度、pH 3個因素中一個因素取零點時其余2個因素對芽孢數量的影響。

圖5 糖蜜和復合氮源對GM1菌體密度影響的響應面圖Fig.5 Response surface ofmolasses and complex nitride on the spore production of GM1

圖6 復合氮源和初始對GM1菌體密度影響的響應面圖Fig.6 Response surface of complex nitride and pH on the spore production of GM1

圖7 糖蜜和初始pH對GM1菌體密度影響的響應面圖Fig.7 Response surface of themolasses and pH on the spore production of GM1

由圖5～圖7可知，3個響應面均為開口向下的凸形曲面，說明響應值（活菌數）存在極高值。3個響應曲面的等高線中心均位于-1～1之間，說明設計的最優條件存在于所設計的因素水平范圍之內。由圖5～圖7及軟件分析可知，回歸方程存在穩定點（0.24，0.08，-0.19），即當糖蜜濃度3.24%、復合氮源0.41%，pH為7.91時，該模型預測的GM 1活菌數為3.03×108CFU·m L-1，考慮到實際應用，選取條件為糖蜜3.2%、復合氮源0.4%，pH為8.0，在該條件下進行了驗證實驗，3次實驗平均活菌數為3.09×108CFU·m L-1，與理論值相差2.01%。進一步說明該模型能較好地預測實際發酵情況。活菌體數比優化前（2.21×108CFU·m L-1）提高了40%，由此可知響應面分析法優化微生物發酵條件是一種十分有效的方法。

3 結論

本實驗主要從發酵培養基原料易得，且成本低廉出發，用響應面法優化提高膠質芽孢桿菌發酵密度，適合用于大規模的工業化發酵生產生物肥料。通過對二次多項回歸方程求解得知，最佳發酵培養基配方為：糖蜜3.24%、復合氮源0.41%，pH為7.91，在此條件下最大理論數值為3.03×108CFU·m L-1。經過3次平行實驗驗證，該模型是合理可靠的。優化后的GM 1活菌濃度與優化前菌體濃度相比提高了40%，進一步說明該模型能較好地預測實際發酵情況。在實際生產中，考慮到操作的方便性，可將培養基配方改為：糖蜜3.2%，復合氮源0.4%，pH為8.0。本實驗對微生態制劑的研制具有一定的理論指導意義。

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App lication of response surface methodology to optim ize the spore production of B.mucilaginosus GM 1

LIDong-hua，YANG Bo*
（School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510006，China）

Using shaking-flask fermentation in the laboratory to op tim ize the com ponents of GM 1 fermentation medium.On the basis of sing le experiments and accord ing to the Box-Behnken experimental design p rincip les，the response surface methodology was app lied to op tim ize the three major fac tors for GM1 liquidstate fermentation.By solving the quad ratic reg ressionmodelequation，the op timal values of the variab les were determ ined as：the molasses 3.24%，com p lex nitride 0.41%，pH7.91.Then the largest number of bacteria p redic ted by the theoretical model was 3.0293×108CFU·m L-1.With the op timum medium，the live bacteria number was 3.09×108CFU·m L-1，which increased nearly more than 40%contrasting on the initial culture medium.On the conc lusion that response surface methodology was an availab le way to op tim ize the fermentation conditions.

Bacillus mucilaginosus；response surface method；colony-form ing units；op tim ization

TS201.3

B

1002-0306（2012）22-0206-04

2012－06－12 *通訊聯系人

李東華（1986-），男，碩士，主要從事發酵工程、微生態制劑方面的研究。