鄰苯二甲醛熒光衍生化法測定食用海藻中還原型谷胱甘肽

李鉉軍，韓 玲，朱愛花，崔勝云

（延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林延吉 133002）

鄰苯二甲醛熒光衍生化法測定食用海藻中還原型谷胱甘肽

李鉉軍，韓 玲，朱愛花，崔勝云*，?

（延邊大學長白山生物資源與功能分子教育部重點實驗室，吉林延吉 133002）

用質譜和光譜測定方法研究了OPA和還原型谷胱甘肽（GSH）熒光衍生化反應，發現OPA分子苯環上相鄰醛基的歧化反應，使得其與GSH發生衍生化反應時生成三環和二環結構的兩種衍生化產物，其中三環結構的衍生化產物具有較強的熒光發射特性。利用OPA熒光衍生化法分別測定了馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中GSH的含量。在含OPA的PBS緩沖溶液、激發波長λex=350nm時，樣品溶液在428nm處發射靈敏的熒光，檢測限達3.6×10-8mol/L。用標準加入法分別測定樣品中GSH含量分別為：0.0714mg/g（馬尾藻），0.1183mg/g（鹿角菜），0.1970mg/g（龍須菜），方法的回收率達到99.22%～100.41%。

谷胱甘肽，鄰苯二甲醛，馬尾藻，鹿角菜，龍須菜，熒光發射

馬尾藻（Sargassum siliquastrum）、鹿角菜（Silvetia siliquosa）、龍須菜（Gracilaria lemaneiformis）是我國沿海盛產的藥食兩用藻類，由于其含有在人體內具有重要活性功能的活性成分和味美可口被人們視為健康食品廣泛食用。據國內外文獻報道，上述藻類提取物中海藻多糖具有抗氧化、抗癌、提高免疫力等活性功能[1-3]。至于其他活性成分測定，目前報道的還有蛋白質、氨基酸、萜類、甾醇類、生物堿、維生素、抗生素、環狀多硫化合物、大環內酯類、微量元素等[4-5]，但鮮見還原型谷胱甘肽（GSH）含量測定的報道。GSH是動、植物體內廣泛分布的含半胱氨酸殘基的三肽，在生物體內參與構成重要的抗氧化防御系統，具有細胞信號轉導、抗氧化、參與氨基酸吸收和轉運、基因表達、抗癌、重金屬解毒等多種生物活性功能[6-10]。由于GSH分子中含氧化性的巰基和可被水解的兩個肽鍵，故只在特定的細胞環境中穩定存在。通常分析操作中的樣品破壁提取、分離等前處理過程，會帶來有別于胞內的相對苛刻的化學環境，這會導致肽鍵的水解和巰基的氧化變性，無法得到GSH的完整的分析信息，這可能是許多生物樣品測試結果中盡管有氨基端含量信息，但缺少GSH含量信息的原因。這一信息缺失對植物生物活性成分定位中GSH的活性地位的評價也帶來困難。本研究利用含OPA衍生化試劑的PBS緩沖液作為提取液，采用細胞破壁、衍生化為一體的樣品前處理方法來生成相對穩定的熒光衍生化產物，避開導致樣品前處理過程中GSH的肽鍵斷裂和巰基的氧化變性所致的漏檢或靈敏度降低的化學環境，由此靈敏測定了馬尾藻、鹿角菜和龍須菜中的GSH的含量，同時對熒光衍生化反應機理也進行了進一步的探討。本研究對上述食用藻類中GSH營養地位及GSH含量測定的方法學研究具有實際意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

馬尾藻、鹿角菜、龍須菜 均購自山東省青島市；還原型谷胱甘肽 Aldrich公司；鄰苯二甲醛 國藥化學試劑公司；實驗用水 三次蒸餾水；其他試劑 均為分析純；

RF-5301PC熒光分光光度儀 日本島津公司；HP1100-1946A液-質聯用儀 美國惠普公司；UV-8500紫外分光光度儀 天美公司；KQ-500DE數控超聲波清洗器；UP-400S超聲波細胞粉碎機；Mini-10K微型離心機；AP-220ZN空氣泵；pHS-3C實驗室酸度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 光譜測定OPA溶液的配制 在容量瓶中用適量甲醇溶解一定量的OPA，然后加入PBS緩沖溶液定容并配制成1×10-2mol/L貯備液，測定時用PBS緩沖溶液稀釋即得。

1.2.2 待測樣品的提取 準確稱取0.2g在80℃烘箱干燥2h后的藻類于50mL錐形瓶中，加入含有一定濃度衍生化試劑（OPA）的0.02mol/L的PBS緩沖溶液20mL作為提取液，超聲破壁40min，抽濾，取清液。取10mL清液，加入2倍體積乙醇，放置30min，以8000r/min離心5min除蛋白，取上清液作為供試品。測定時取1mL供試品加入PBS緩沖液定容至10mL進行測定。

1.2.3 質譜測定 實驗中發現，熒光衍生化反應受酸度的影響較大，但在pH=7～8的酸度范圍內的PBS緩沖溶液中，OPA和GSH皆生成穩定的熒光衍生化產物。為了減小緩沖液鹽對質譜儀的影響，質譜測定溶液是分別稱取一定量的OPA于兩個容量瓶中，用適量甲醇溶解，其中一份加入一定量的GSH，再分別用三次蒸餾水稀釋、定容來配制pH=7的OPA溶液和OPA和GSH混合溶液。所配制的溶液從HP1100-1946A液-質聯用儀質譜端口進樣，測定質譜圖。質譜條件為：離子源：ESI；碰撞電壓：70eV；干燥氣：氮氣；干燥器流量：4L/min；干燥氣溫度：350℃；霧化器壓力：55psi；毛細管電壓：3500V。

1.2.4 樣品測定 參照Cohn和Leroy等[11-12]確立的GSH和OPA熒光衍生化法測定GSH的方法。分別取提取液4mL于6份具塞試管中，其中5份加入PBS緩沖液配制的GSH標準系列溶液，然后用PBS緩沖液皆定容至5mL。選擇350nm波長為激發波長，記錄428nm處的熒光發射強度。利用熒光發射強度與GSH濃度之間的線性關系，利用標準加入法進行GSH含量測定。

1.3 數據處理

數據處理、回歸分析及畫圖是使用Origin數理統計和畫圖軟件。

2 結果與分析

2.1 OPA和GSH熒光衍生化反應

Leroy等[12]報道，OPA和GSH在PBS（pH=8.0）緩沖溶液中發生反應生成具有三元環狀的衍生化產物，該衍生化產物具有較強的熒光發射能力，借此可用熒光分光光度法靈敏測定GSH的含量。由于OPA的苯環鄰位兩個醛基通常在弱堿性條件下易發生Canizzaro歧化反應，因此溶液的酸度對衍生化產物的生成可能有影響。為了探討OPA歧化反應對衍生化反應的影響，利用電噴霧質譜端口分別測定了OPA和OPA+GSH混合溶液的質譜圖，結果見圖1。

圖1 OPA和GSH混合溶液的質譜圖Fig.1 Mass spectra of OPA and GSH mixture solution

如圖1所示，OPA分別在m/z=135.0和m/z=149.1處觀察到OPA的質子化的分子離子峰和鄰苯二甲酸酐的質子化的分子離子峰。當OPA溶液中含有GSH時，除了m/z=308.1處的GSH的質子化的分子離子峰外，分別在m/z=406.1和m/z=424.1處分別出現OPA和GSH相互作用生成的兩種衍生化產物的質譜峰。圖1的結果表明，OPA在中性水溶液中也發生歧化反應生成鄰-羧基-苯甲醇，該歧化產物在電噴霧氣相中脫水縮合生成鄰苯二甲酸酐，同時也發現由于OPA的歧化反應導致生成兩種與GSH作用產物。

為了進一步探討OPA的歧化作用對與GSH衍生化反應及其光譜特性的影響，在pH=8的PBS緩沖溶液中分別測定了OPA和OPA+GSH的混合溶液的UV-vis吸收光譜并設定衍生化產物的最大吸收波長作物激發波長測定了熒光發射光譜圖，結果見圖2。

如圖2（A）所示，OPA溶液只出現λmax=258nm處出現苯環π→π*躍遷的B吸收帶和λmax=300nm處出現羰基n→π*躍遷所致吸收帶。當溶液中含GSH時，分別在λmax=340nm處和λsh=350nm處出現衍生化產物的吸收峰和吸收肩峰。分別選擇該吸收波長為激發波長，測定OPA+GSH的混合溶液的熒光光譜，見圖2（B），盡管λmax=340nm處比起λsh=350nm具有較強的吸收強度，但所對應的的衍生化產物的熒光發射強度弱于λsh=350nm所對應的熒光發射強度，說明λsh=350nm具有吸收肩峰的熒光衍生化產物具有較強的熒光發射能力。根據圖1～圖2的質譜和光譜解析，OPA和GSH的混合溶液中發生圖3所示衍生化反應。

圖2 OPA和GSH混合溶液的UV-vis吸收光譜圖和熒光光譜圖Fig.2 Uv-vis spectra and fluorescent spectra for mixture solutionof OPA and GSH

圖3 OPA和GSH衍生化反應Fig.3 Derivatizing reaciont between OPA and GSH

如圖3所示，OPA與GSH衍生化反應包括OPA的兩個醛基和GSH的巰基和胺基的直接縮合反應和OPA經歧化后通過苯環上的羥基和羧基與GSH巰基和胺基的縮合反應。直接縮合產物分子具有較高的共軛度和三元環狀結構的剛性結構、故該衍生化產物的熒光發射能力比起OPA歧化后的縮合生成的衍生化產物更強。

2.2 GSH含量測定

圖4分別為含過量OPA的馬尾藻、鹿角菜、龍須菜提取液及該提取液加GSH標準系列溶液時的熒光發射光譜圖。

圖4的結果表明，在含OPA的提取液在428nm發出較強的熒光，說明樣品提取液中含有GSH，當該提取液中加入GSH標準溶液時，熒光法射強度隨加入GSH的濃度呈良好的線性關系，其回歸方程分別為If=1.52731+2.32532C（馬尾藻），If=2.37603+1.14786C（鹿角菜），If=2.85815+0.83633C（龍須菜），相關系數均大于0.99。根據圖4～圖5的測定結果和回歸方程，用標準加入法測定了馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中的GSH含量，結果見表1。

圖4 樣品的熒光光譜圖Fig.4 Fluorescent spectra of the sample

表1 GSH含量測定結果Table 1 Determination results for GSH

表1結果表明，標準加入法測定馬尾藻、鹿角菜、龍須菜中的三次測定GSH的平均值分別為0.0714、0.1183、0.1970mg/g，回收率范圍98.69%～100.41%。檢測限是參照文獻[13]進行了測定。利用標準GSH溶液測定了熒光光譜圖，發現熒光發射強度在1×10-7～1×10-6mol/L呈良好的線性關系，其線性回歸方程為If=0.1542+2.2364CGSH。然后在相同條件下分別平行測定空白溶液8次，其熒光值（）為0.8985±0.02124。根據YE=μ+kσ（式中，YE指可被檢出的最小分析信號，指平均空白信號值，k為置信度相關的整數，這里取k=3，μ代表平均空白信號值、σ代表標準偏差）則YE=0.8985+3×0.02124，將其代入線性回歸方程換算得檢測限為3.6×10-8mol/L。

3 結論

3.1 由于OPA的歧化作用，在pH=7~8的溶液中OPA和GSH相互作用生成兩種衍生化產物。一種是OPA的相鄰醛基與GSH的巰基和胺基縮合生成的三環共軛結構的衍生化產物，另一種是OPA歧化產物的羧基和羥基與GSH的巰基和胺基縮合生成二環共軛產物，其中前者具有更強的熒光發射能力。

3.2 在過量OPA的PBS緩沖溶液中，OPA和GSH的衍生化產物所發射的熒光強度與GSH濃度間呈良好的線性關系，加標回收率也達到98%以上。因此，在本研究實驗條件下盡管發生OPA的歧化作用，但仍可準確測定GSH的含量。

3.3 馬尾藻、鹿角菜、龍須菜三種可食藻類中都含較豐富的GSH，其中龍須菜中GSH的含量最高，達到0.1970mg/g。

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Determination of glutathione in edible marine algae using OPA fluorescence derivatizing method

LI Xuan-jun，HAN Ling，ZHU Ai-hua，CUI Sheng-Yun*，?
（Key Laboratory of Natural Resources of Changbai Mountain&Functinal Molecules，Ministry of Education Yanbian University，Yanji 133002，China）

The derivatizing reaction between OPA and reduced glutathione（GSH） were investigated using ESIMS，spectrometric analysis.Because of Cannizaro reaction of OPA in the solution，two derivitized products had been formed with conjugated tricyclic structure and bicyclic structure，in which much more fluorescent emmision properties was observed by derivatized product with tricyclic conjugated structure.In PBS buffer soluiton，using OPA as derivatizing agent，GSH content in Sargassum siliquastrum，Silvetia siliquosa，Gracilaria lemaneiformis had been determined by fluorometryic analysis.In OPA+PBS mixture buffer solution with excitation wavelength at 350nm，the sample emmited strong fluorescence at 428nm，the detection limit was 3.6×10-8mol/L.GSH contents determined with standard addition methods in the samples were 0.0714mg/g（Sargassum siliquastrum），0.1183mg/g（Silvetia siliquosa），0.1970mg/g（Gracilaria lemaneiformis） respectively，and the reconveries were in the range of 99.22%～100.41%.

glutathione；OPA；Sargassum siliquastrum；Silvetia siliquosa；Gracilaria lemaneiformis；fluorescence

0652.3

A

1002-0306（2012）22-0081-04

2012－06－12 *通訊聯系人 ?并列第一作者

李鉉軍（1977-），男，碩士，講師，研究方向：食品分析。

崔勝云（1957-），男，博士，教授，研究方向：生物有機分析。

國家自然科學基金（21165021）。