魯米諾-鐵氰化鉀流動注射化學發光體系測定飲用水中ɑ-茄堿

朱定波，馬 強，燕 廷，滕久委，唐書澤

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州 510632）

魯米諾-鐵氰化鉀流動注射化學發光體系測定飲用水中ɑ-茄堿

朱定波，馬 強，燕 廷，滕久委，唐書澤*

（暨南大學食品科學與工程系，廣東廣州 510632）

建立一種快速測定ɑ-茄堿的新方法，利用魯米諾-鐵氰化鉀化學發光體系，結合流動注射技術，對ɑ-茄堿進行測定。實驗結果表明，ɑ-茄堿對魯米諾-鐵氰化鉀體系發光反應有明顯的抑制作用，在最佳實驗條件下，該方法的線性范圍為8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL，檢出限為6.09×10-5mg/mL，RSD為2.1%（n=11）。 該方法具有操作簡單、自動化程度高、成本低廉、容易實現在線檢測以及即時預警等優點，可用于飲用水中ɑ-茄堿的快速檢測。

魯米諾，鐵氰化鉀，化學發光，ɑ-茄堿

馬鈴薯植株和其塊莖中普遍含有一種有異味、有毒的生物堿，通稱為龍葵素、龍葵堿、茄堿、馬鈴薯素等[1]。這種生物堿不是單一成分，而是一類具有糖苷鍵的含氮甾體化合物，主要成分是ɑ-茄堿（ɑsolanine）和ɑ-卡茄堿（ɑ-chaconine），其含量達到龍葵素總量的95%以上[2]，且ɑ-茄堿在一定范圍內變化[3]，據相關研究報道ɑ-茄堿是主要的制毒物質[4]，即ɑ-茄堿可以作為龍葵素毒性的一個指標。通常情況下，龍葵素含量較低時不會影響食用品質，但當馬鈴薯因儲藏不當、發芽變綠或腐爛時，會導致龍葵素含量大幅度升高，若人畜食用0.2g龍葵素時即可出現中毒癥狀，嚴重者會出現致畸或死亡的危險[5]。龍葵素的致毒機理是抑制體內的膽堿酯酶的活性，膽堿酯酶催化神經遞質乙酰膽堿的水解，生成膽堿和乙酸，該酶被抑制失活后，造成乙酰膽堿的積累，膽堿會使神經興奮增強，引起胃腸肌肉痙攣等一系列中毒癥狀[6]。龍葵素中毒已有發生，2009年長春東亞經貿新聞就報道了一起九臺市慶陽中心學校中小學生龍葵素中毒事件[7]。雖然飲用水中目前沒有中毒報告，但龍葵素容易獲得，其潛在的危害不容忽視。因此，研究建立快速監測飲用水中龍葵素的變化，對飲用水早期安全預警具有重要的意義。目前國內外對于馬鈴薯中ɑ-茄堿的測定方法主要有稱重法[8]、比色法[9]、薄層色譜掃描法[10]、酶聯免疫法[11]和高效液相色譜法[12]等。其中稱重法誤差大，比色法、薄層色譜掃描法和酶聯免疫法前處理過程比較復雜，且比色法和薄層色譜掃描法也不能對ɑ-茄堿進行準確的定量分析。高效液相色譜法成本又較高。近年來，化學發光分析法以其儀器簡單、靈敏度高、操作方便等優點被應用到食品、環境監測和藥物分析等領域[13-15]。用流動注射化學發光法測定龍葵素中的ɑ-茄堿的研究未見報道。本實驗旨在研究ɑ-茄堿對魯米諾-鐵氰化鉀發光體系發光強度的影響作用，同時，建立一種簡單、快速、靈敏度高的化學發光體系，用于飲用水中ɑ-茄堿突然變化的快速監測和早期安全預警。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魯米諾儲備液（0.01mol/L） 稱取0.4430g魯米諾（Sigma公司），用25mL 1mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容至250mL棕色容量瓶中，避光放置1周后使用；鐵氰化鉀儲備液（0.01mol/L） 稱取0.3295g鐵氰化鉀，用少量二次水溶解，定容至100mL棕色容量瓶中，避光儲存備用；ɑ-solanine 上海Sigma試劑公司；硫酸分析純，廣州化學試劑廠；氫氧化鈉 分析純，天津市大茂化學試劑廠；實驗用水 雙蒸水。

IFIS-C型流動注射化學發光儀、RFL-1型超微弱化學發光/生物發光檢測儀 西安瑞邁電子科技有限公司；RF-5301熒光分光光度計 日本島津公司；PHS-3C數字式pH計 上海精密科學儀器有限公司；EL104電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；DHG-9145A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；0.1～1mL、0～50μL微量移液槍 德國BRAND公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 進樣方法 按圖1所示連接流動注射化學發光分析路徑，a、b、c 3個流通管道分別插入ɑ-茄堿溶液（樣品）、鐵氰化鉀溶液、魯米諾溶液。魯米諾溶液首先與鐵氰化鉀溶液經三通閥V混合反應，再和ɑ-茄堿溶液混合，進入反應池F反應產生化學發光信號，由光電倍增管（PMT檢測），信號經放大器放大，進入計算機處理。據此得到最大且重復性較好的發光信號。

圖1 流動注射化學發光法流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow-injection chemiluminescence system

1.2.2 熒光光譜分析 應用島津RF-5301PC熒光光度計分別對魯米諾、魯米諾-鐵氰化鉀混合液、魯米諾-鐵氰化鉀-ɑ-茄堿混合液進行熒光光譜分析。

1.2.3 單因素的選取和實驗 選取影響化學發光強度的四個因素：魯米諾濃度、鐵氰化鉀濃度、魯米諾溶液pH、ɑ-茄堿分析液的pH進行單因素實驗，考察各因素對相對化學發光強度的影響。

1.2.4 正交實驗設計 根據單因素實驗結果，將對實驗結果有影響的四個因素，采用L9（34）正交表進行正交實驗設計（見表1）。

2 結果與分析

2.1 各溶液發射光譜圖

從圖2中可以看出：魯米諾的最強發射波長點在425nm處，發光體是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發態。加入鐵氰化鉀后，發射波長仍然在425nm處且相對熒光強度有明顯增強，但發光體仍是3-氨基鄰苯二甲酸根離子的激發態。加入ɑ-茄堿后，ɑ-茄堿首先與鐵氰化鉀發生配位反應，反應的絡合物抑制了魯米諾-鐵氰化鉀的熒光強度。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

圖2 發射光譜圖Fig.2 Fluorescence spectrum

2.2 單因素對化學強度的影響

2.2.1 魯米諾濃度的選擇 魯米諾作為發光試劑，其濃度大小直接影響化學發光強度。本研究考察了在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內魯米諾溶液濃度與化學發光強度的關系見圖3。隨著魯米諾溶液濃度的增大，反應體系的化學發光強度也不斷增大。基于實驗成本和環境污染等方面的綜合考慮，魯米諾初選濃度為2.0×10-4mol/L。

圖3 魯米諾濃度對相對化學發光強度的影響Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

2.2.2 鐵氰化鉀濃度的選擇 鐵氰化鉀是該發光體系的氧化劑，其濃度在一定范圍內影響化學發光強度。在5.0×10-5～1.0×10-3mol/L范圍內鐵氰化鉀濃度與化學發光強度的關系見圖4。鐵氰化鉀溶液濃度為4.0×10-4mol/L時靈敏度較高，相對化學發光強度較理想。因此，選擇鐵氰化鉀最佳濃度為4.0×10-4mol/L。

2.2.3 ɑ-茄堿分析液的pH的選擇 ɑ-茄堿分析液的pH對體系發光強度影響見圖5。當pH為4時，體系化學發光強度最強，這是由于魯米諾的化學發光反應要求在堿性介質中進行，而在堿性介質中ɑ-茄堿會沉淀，因此必須保證足夠的酸度，以保證ɑ-茄堿的穩定存在，因此初步選擇ɑ-茄堿分析液的pH為4。

圖4 鐵氰化鉀對相對化學發光強度的影響Fig.4 Effect of K3Fe（CN）6concentration on relative luminescence intensity

圖5 ɑ-茄堿溶液pH對相對化學發光強度的影響Fig.5 Effect of pH value of ɑ-solanine concentration on relative luminescence intensity

2.2.4 緩沖液pH的選擇 緩沖液pH對體系發光強度影響見圖6。當魯米諾pH為12.8時，體系化學發光信號最強，因此，初選魯米諾緩沖液pH為12.8。

圖6 魯米諾溶液pH對相對化學發光強度的影響Fig.6 Effcet of pH of luminal solution onrelative luminescence intensity

2.3 多因素組合對化學發光強度的影響

根據以上單因素實驗得出的最佳反應條件，設計了一個四因素三水平的正交實驗（表2）以確定發光體系的最佳反應條件。

實驗結果見表2，各因素影響化學發光程度大小順序為A＞D＞B＞C，推出體系最佳優化組合為A3B2C1D2，即魯米諾分析液濃度為4.0×10-4mol/L，鐵氰化鉀濃度為4.0×10-4mol/L，ɑ-茄堿分析液pH為3，緩沖液pH為12.8，驗證實驗得其相對化學發光強度為14437.5。

2.4 標準曲線、精密度及檢出限

在上述選定的最佳實驗條件下，化學發光強度在8.0×10-4～9.0×10-3mg/mL，1.0×10-2～1.0×10-1mg/mL內呈良好的線性關系。其回歸方程如表4。對2×10-3mg/mL的ɑ-solanine進行11次平行測定，其相對標準偏差為2.1%。根據IUPAC建議，計算出檢出限為6.09×10-5mg/mL。

表2 正交實驗方案及結果Table 2 Orthogonal array design matrix and test results

表3 正交實驗方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal test results

表4 校準曲線的線性范圍及回歸方程Table 4 Linear range and regression equation of the calibration curves

2.5 干擾實驗

在最佳優化實驗條件下，研究了可能的共存物質對ɑ-茄堿測定的影響，當ɑ-茄堿溶液濃度為2×10-3mg/mL時，干擾允許誤差為±5.0%時，實驗結果表明，1000倍的K+、Na+、NO3-、Fe3+、Cl-，200倍的Mg2+、Ca2+、Al3+等常見離子無干擾，1倍的AS3+、Pb2+、Mn2+、Zn2+、Cd2+、Cu2+、Cr3+、Hg+等會催化魯米諾-鐵氰化鉀化學發光體系，對測定產生干擾，方法選擇性不好。為了避免金屬離子的干擾，可以加入0.5%（v/v）的5.0×10-4mol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）作為掩蔽劑消除金屬離子的干擾。

2.6 樣品分析及回收率實驗結果

表5 樣品中茄堿含量測定結果Table 5 Results of ɑ-solanine content in water

在最佳優化實驗條件下，以實驗室自來水、宿舍自來水作為水樣測定ɑ-茄堿含量。然后采取標樣加入法加入2×10-3mg/mL ɑ-茄堿對其進行測定，結果如表5所示。

3 結論

ɑ-茄堿對魯米諾-鐵氰化鉀化學發光體系發光強度有明顯的抑制作用。據此建立了在最佳條件下測定ɑ-茄堿的分析方法，實現了流動注射化學發光法測定飲用水中ɑ-茄堿的變化情況，該方法的檢出限達6.09×10-5mg/mL，線性范圍是8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL。與常規方法相比，該方法具有儀器簡單、快速、自動化程度高以及即時預警等特點，可應用于飲用水中ɑ-茄堿快速突變的檢測。

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Determination of ɑ-solanine in drinking water by flow-injection chemiluminescence system of luminol and potassium ferricyanide

ZHU Ding-bo，MA Qiang，YAN Ting，TENG Jiu-wei，TANG Shu-ze*
（Food Science and Technology Department，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

In order to establish a new method for rapid determination of ɑ -solanine， a flow-injection chemiluminescence（FI-CL） system of luminol and potassium ferricyanide was developed.Results indicated that the CL reaction betweeen luminol and potassium ferricyanide was significantly reduced by ɑ-solanine.An excellent linear range for ɑ-solanine determination was 8.0×10-4～1.0×10-1mg/mL under the optimal condition.The limit detection of ɑ-solanine was 6.09×10-5mg/mL and relative standard deviation for the determination was 2.1%（n=11）.This method showed the advantages of simple operation，high degree of automation，easy to run on-line and real-time warning detection，and could be used as a rapid method for determination of ɑ-solanine in drinking water.

luminol；potassium ferricyanide；chemiluminescence；ɑ-solanine

TS201.6

A

1002-0306（2012）22-0084-04

2012－05－28 * 通訊聯系人

朱定波（1986-），男，碩士在讀研究生，研究方向：食品安全預警。

廣東省食品安全衛生應急技術中心（粵科函社字[2011]733號）。