高效液相色譜-Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2化學發光體系檢測啤酒中的亞硫酸鈉

龍星宇，陳福南

（西南大學化學與化工學院，重慶 400715)

高效液相色譜-Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2化學發光體系檢測啤酒中的亞硫酸鈉

龍星宇，陳福南*

（西南大學化學與化工學院，重慶 400715)

在酸性條件下，Ce（SO4）2氧化Ru（bipy）32+時，在Na2SO3存在下，對該化學發光具有很強的增敏作用，據此建立通過HPLC分離、用化學發光檢測器測定亞硫酸鈉的方法。在優化的實驗條件下，測定亞硫酸鈉的線性范圍為2.0×10-6～ 5.0×10-4g/mL，方法的檢出限為6.0×10-7g/mL，定量下限為2.0×10-6g/mL，線性回歸方程：ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），對5.0×10-5g/mL亞硫酸鈉進行了11次平行測定，其相對標準偏差為3.7%。該法已成功的運用于實際啤酒樣中亞硫酸鈉的含量。

高效液相色譜，化學發光，釕聯吡啶，硫酸鈰，亞硫酸鈉

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水亞硫酸鈉 浙江省永嘉縣化工試劑廠，分析純，批號：國藥準字100408；乙腈 色譜純，Fisher Scientific公司；釕（Ⅱ）聯吡啶 Newburyport，USA；硫酸鈰 國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20080303；水 超純水。

KromasilTMC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）Dikma Technologies公司；高效液相色譜-化學發光分析檢測系統如圖1所示；D-7000HPLC高效液相色譜儀，L-7100泵 Hitachi，Japan；微弱發光分析檢測儀MCFL-A，西安瑞邁；AGE微量進樣器（50μL） 寧波市鎮海玻璃儀器廠；CQ-2200型超聲波清洗器 上海滬超超聲波儀器有限公司；UNIQUE-R10多功能超純水機 銳思捷；HL-2恒流泵 上海清浦滬西儀器廠。整個檢測分析過程中實驗數據的采集和處理，均由Windows XP系統下D-7000 HSM軟件（Hitachi.Ltd. 1994-2001 Version 4.0）和BPLC軟件共同完成。

圖1 高效液相色譜-化學發光法檢測系統示意圖Fig.1 HPLC-CL detection system

1.2 實驗方法

1.2.1 溶液的配制 0.1mol/L硫酸鈰儲備液：準備稱取4.0400g硫酸鈰，用0.05mol/L的H2SO4溶液溶解并定容至100mL的容量瓶中；實驗條件中所用濃度，皆是用0.5mol/L硝酸稀釋至所需濃度。1.0×10-3g/mL釕聯吡啶儲備溶液：精確稱量0.1000g的釕（Ⅱ）聯吡啶用水定容至100mL的容量瓶中。1mg/mL亞硫酸鈉儲備液：稱量亞硫酸鈉約0.1g左右，溶解于流動相中，超聲溶解5min，定容至100mL的容量瓶中，并用碘量法標定后使用。并于當天臨用時現配。以上試劑使用時逐級稀釋。

1.2.2 實驗條件 KromasilTMC18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）。流動相：乙腈-水（40∶60，v/v），在使用前經0.22μm濾膜抽濾超聲脫氣（15min）處理；流速：0.8mL/min；進樣量：20μL；柱溫：室溫；壓強：大氣壓。

1.2.3 操作方法 按圖1將裝置安裝好進行操作，儀器預熱20min，設置好儀器參數，初始化儀器軟件。在使用高效液相色譜前，分別用超純蒸餾水及流動相充分沖洗柱子，待基線穩定后，取用碘量法標定好的亞硫酸鈉標準溶液或啤酒樣品溶液20μL進樣，記錄儀記錄化學反應的發光信號，以相對峰高定量（三次求平均）。

1.2.4 樣品處理 對市售四種不同品牌的啤酒樣液先經0.22μm濾膜過濾，濾液密封保存在4℃冰箱中待用，保存時間不超過2d。

2 結果與討論

2.1 化學發光條件

2.1.1 介質酸的選擇 分別考察了H3PO4、HCl、HNO3、H2SO4四種酸介質，對此化學發光體系的影響。提供酸性環境，使氧化劑Ce（Ⅳ）處于活性氧化劑狀態。實驗發現HNO3作為介質時，可使化學發光強度達到最大，這可能是由于HNO3本身具有較強的氧化性[12]。所以，本實驗選擇HNO3為酸性介質。

2.1.2 介質酸HNO3的濃度 在酸性環境當中，氧化劑的氧化能力顯著增強。我們考察了HNO3在0.2～ 2.0mol/L范圍內，該發光體系化學發光的強度。在此濃度范圍內，隨著酸的濃度增加，化學發光強度明顯減小，之后變化不大趨于平穩（如圖2所示），這可能是由于溶解氧化劑硫酸鈰時所用的0.5mol/L硫酸，足以保證氧化劑以足夠多的活性氧化態形式存在。所以，本實驗選擇HNO3的最佳濃度為0.5mol/L。

圖2 硝酸濃度的影響Fig.2 Effect of HNO3concentration

2.1.3 Ru（bipy）32+的濃度 Ru（bipy）32+作為發光試劑，其濃度對化學發光強度起著非常重要的作用。在選定的介質硝酸及其濃度的前提下，固定其它條件不變，研究Ru（bipy）32+的濃度在2.0×10-5～5.0×10-4g/mL范圍內化學發光體系的相對化學發光強度。實驗表明，隨著發光試劑濃度的不斷增加，ΔI值不斷增大，但當其濃度超過8.0×10-5g/mL時，盡管發光信號增大，但背景值也隨之升高，即ΔI值減少。綜合考慮發光強度與背景值各自因素的影響，最終選取8.0×10-5g/mL作為Ru（bipy）32+的最佳濃度（見圖3）。

圖3 釕聯吡啶濃度的影響Fig.3 Effect of Ru（bipy）32+concentration

2.1.4 Ce（SO4）2的濃度 Ce（SO4）2作為氧化劑，在該化學發光體系中的作用不可忽視。固定其它條件不變，分析了Ce（SO4）2在4.0×10-4～1.5×10-3mol/L濃度范圍內的發光信號。如圖4中，當Ce（Ⅳ）濃度過小時，體系不能提供足量的氧化劑，不能使發光強度達到最大，只要滿足體系當中存在足量的氧化劑即可。則本實驗選擇Ce（SO4）2的最佳濃度為8.0×10-4mol/L。

圖4 硫酸鈰濃度的影響Fig.4 Effect of Ce（SO4）2concentration

2.1.5 恒流泵流速 在流動注射化學發光分析中，反應載體的流速是影響化學發光強度的一個重要因素。流速過慢會導致發光在流通池之前；同樣若流速過快會導致發光在流通池之后，不適宜的流速都可能導致在流通池中檢測不到最大發光信號。本文在固定流動相流速（1mL/min）及其它條件不變的情況下，考察了不同流速對化學發光反應的影響。結果表明，隨著流速的增大，發光信號增大，增大到一定程度后，發光信號逐漸降低，兼顧靈敏度和分離度的要求，反應試劑流速選擇為1.45mL/min。

2.2 色譜分離條件

2.2.1 流動相 一般常用作流動相中的有機相為甲醇和乙腈。考察了甲醇-水、乙腈-水相同比例下，在該化學發光體系中二者之間的相對發光強度。結果發現，兩種不同的流動相均可對目標物質進行分離，并都對發光體系有抑制，盡管甲醇-水對化學發光抑制要小，但其基線不穩，易發生漂移；乙腈-水對化學發光的抑制較大，但其基線較平，背景值較小，峰形對稱。因此我們選擇乙腈-水作為色譜分離的流動相。進一步考慮乙腈的體積分數對化學發光信號的影響。實驗表明，乙腈的體積分數為30%～70%之間的流動相，都可以使亞硫酸鹽與其它成分得到很好地分離，保留時間相差不是很大。當其為40%時可檢測到化學發光強度最大，而乙腈體積分數大于40%時，化學發光強度急劇下降。所以，我們選用乙腈∶水= 40∶60（v/v）的流動相。

2.2.2 高壓泵流速 我們探究了0.5～1.3mL/min范圍內的高壓泵流速。實驗發現高壓泵流速快，保留時間短，但是分離不徹底。反之，若高壓泵流速慢，流動相與發光體系易形成高的背景值，而且峰形較寬，峰展寬較大。綜合考慮分離效果與信噪比，實驗選擇高壓泵最佳流速為0.8mL/min。

2.3 校準曲線、相對標準偏差和檢出限

在上述選定的最佳實驗條件下，亞硫酸鈉的濃度在2.0×10-6～5.0×10-4g/mL范圍內與相對發光強度呈良好的線性關系，其線性回歸方程為ΔI=3.578c+19.721（c：g/mL）；r2=0.9984；根據IUPAC建議，按3倍空白信號的標準偏差計算，方法的檢出限為6.0×10-7g/mL。對5.0×10-5g/mL濃度的亞硫酸鈉平行測定11次，其相對標準偏差為3.7%。亞硫酸鈉的保留時間為2.15min。

2.4 樣品分析

一份準確量取1mL濾液（1.2.4方法中已處理好的濾液）于10mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，根據圖1所示，進行樣品測定；另一份準確量取1mL濾液（1.2.4方法中已處理好的濾液）于小燒杯中，并加入1mL 1mol/L HNO3，置于超聲清洗儀中超聲處理5min驅趕二氧化硫氣體后，再轉入10mL容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，按1.2.3進行測定，兩份樣品溶液化學發光強度的差值即為亞硫酸根所產生的化學發光強度。圖5為所加入的HNO3對啤酒樣品處理的色譜圖及HNO3空白色譜圖。實驗表明，酸化處理前后，亞硫酸鹽的特征保留時間處不受干擾可以用于定量分析，整個分析時間不超過400s。圖6為實測亞硫酸鈉和實際啤酒樣品的色譜分離圖。HPLCCL測定市售四種不同品牌的啤酒中所含亞硫酸鈉的結果見表1。

圖5 HNO3色譜圖Fig.5 HNO3Chromatogram

表1 HPLC-CL方法測定四種市售不同品牌啤酒中亞硫酸鈉的結果Table 1 Results of HPLC-CL method determination sodium sulfite in four kinds of beer sold in the city

圖6 色譜圖Fig.6 Chromatogram

3 結論

本文采用高效液相色譜-化學發光聯用的方法檢測啤酒樣中的亞硫酸鈉，線性范圍為2.0×10-6～5.0× 10-4g/mL，最低檢測限為6.0×10-7g/mL，對5.0×10-5g/mL濃度的亞硫酸鈉平行測定11次，其相對標準偏差為3.7%，精密度較高；回收率在95.1%～103.9%之間，結果也表明，這四種啤酒中亞硫酸鈉的含量均沒有超標。該方法應用于食品中添加劑的測定，對樣品不需要進行酒精的蒸餾，整個分析時間不超過400s，簡便快速、結果準確可靠，并成功應用于啤酒中亞硫酸鈉的檢測。

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Determination of sodium sulfite in beer samples by high performance
liquid chromatography with Ru（bipy）32+-Ce（SO4）2chemiluminescence detection

LONG Xing-yu，CHEN Fu-nan*
（School of Chemistry and Chemical Engineering of Southwest University，Chongqing 400715，China）

The CL radiation was emitted in the reaction of cerium sulfate oxidation reagent with tris （2，2-bipyridyl）ruthenium（Ⅱ）in the presence of acid.The existence of sodium sulfite made the reaction more sensitive

and strong.The optimal conditions for the CL detection were studied and a new method for determining sodium sulfite was described by HPLC-CL.The linear range was 2.0×10-6～5.0×10-4g/mL with the detection limit of 6.0×10-7g/mL，linear regression equation：△I=3.578c+19.721（c：g/mL；r2=0.9984），and the relative standard detection was 3.7%for 5.0×10-5g/mL.This method has obtained satisfactory results in the analysis of sodium sulfite in beer samples.

high-performance liquid chromatography；chemiluminescence；Ru（bipy）32+；Ce（SO4）2；sodium sulfite

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0320-04

亞硫酸鈉是一種重要的食品添加劑，在食品的各種處理過程和儲存環境中，能非常有效地阻止酶和非酶類物質發生酶促反應。同樣，它也可抑制食品中微生物所引起的酸化和酸敗[1-2]。但亞硫酸鹽能誘發部分人出現嚴重的哮喘[3-4]，而且在食品中添加過量的亞硫酸鹽也會使食品喪失原有的香味[5]，此外，亞硫酸鹽在體內被氧化生成硫酸鹽，易刺激消化器官[6]。因此，我國《食品添加劑使用衛生標準》（GB2760-2007）對各類食品中亞硫酸鹽的允許限量有明確規定。我國標準GB/T5009.34規定用鹽酸副玫瑰苯胺比色法來測定[7]，但由于在操作過程中使用劇毒溶液，對環境造成污染，對于復雜樣品的檢測結果不好，干擾因

2011－03－28 *通訊聯系人

龍星宇（1982-），男，碩士研究生，主要從事高效液相色譜和化學發光在食品方面的研究。

西南大學博士基金項目（2120040511）。素多，且檢測時間長。化學發光分析法具有靈敏度高、線性范圍寬、儀器設備簡單等優點，加上高效液相色譜高效分離的特點，使HPLC-CL方法的聯用得以廣泛運用[8-11]，成為一種有效的痕量及超痕量分析技術。三（2，2-聯吡啶）釕（Ⅱ）Ru（bipy）32+是一個靈敏的化學發光試劑，在酸性條件下，以Ce（SO4）2為氧化劑，Na2SO3可以成比例增強Ru（bipy）32+的化學發光強度。據此，建立了以此化學發光體系測定亞硫酸鈉的分析方法，并以HPLC色譜分離，測定實際啤酒樣中亞硫酸鈉的含量。