篤斯越橘產品花色苷抗氧化活性評價

吳 杰，鄭 影，谷思云，王 萍，*，劉曉娜

（東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

篤斯越橘產品花色苷抗氧化活性評價

吳 杰1，鄭 影1，谷思云2，王 萍2，*，劉曉娜2

（東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

對篤斯越橘不同產品花色苷的抗氧化活性進行了研究。首先用60%乙醇提取篤斯越橘產品花色苷，再用AB-8大孔樹脂分離，pH示差法測定花色苷含量，最后采用·OH和DPPH·體系對篤斯越橘產品的抗氧化活性和規律性進行了測定和比較。結果表明，花色苷的抗氧化活性和花色苷含量成顯著正相關。果醬類產品中花色苷含量最高；不同篤斯越橘產品中花色苷抗氧化能力不同。清除·OH的IC50最小的為8.83μg/mL，最大的為43.24μg/mL；清除DPPH·的IC50最小的為10.48μg/mL，最大的為20.40μg/mL。

篤斯越橘產品，花色苷，抗氧化

篤斯越橘（Vaccinium uliginosum Linn.）為杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬（Vaccinium spp.）植物，其成熟的漿果為藍色或藍黑色，外皮一層白粉，故俗稱為“藍莓”（Blueberry），黑龍江省產區也稱“都柿”，是越橘的一個資源品種[1]。篤斯越橘是藍莓的野生品種，在我國的東北地區大面積生長。篤斯越橘含有豐富的花色苷，花色苷是花青素與糖以糖苷鍵結合而成的一類化合物，具有抗氧化[2]、消除自由基、降低血清膽固醇、抗變異、抗腫瘤、抗癌、促進視網膜上視紅素再合成等生理功能，可預防和治療青光眼和其他眼類疾病[3]，因此藍莓被聯合國糧農組織（FAO）確定為人類五大健康食品之一[4]。隨著預防衰老、抗癌等越來越成為人們對飲食生活健康的追求，因此在市場上這類的野生漿果產品琳瑯滿目。而目前國內對篤斯越橘的研究主要集中在鮮果上，對篤斯越橘產品的研究尚少。花色苷容易受到各種因素影響而降解，如溫度、pH、光照、氧氣、酶，并且在各種加工步驟中也易發生降解反應[5]。已有研究證明，當藍莓加工成果汁和果汁濃縮液時有大量的花色苷和酚類物質損失，特別是當磨粉和脫果膠時由于被本身含有的多酚氧化酶氧化降解而產生最大的損失[6]。本實驗選取以東北地區篤斯越橘為原料的產品，通過對花色苷進行分離、純化，分析其體外抗氧化活性，對該產品的生產和消費極具現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍莓篤斯越橘產品 購于各大超市；氫氧化鈉、雙氧水、磷酸氫二鈉、冰乙酸、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、檸檬酸 均為分析純；AB-8大孔樹脂 天津波鴻樹脂科技有限公司；無水乙醇 天津市天力試劑有限公司；DPPH·（2，2-二（4-叔辛基苯基）-1-苦基肼，分子式C34H44N5O6，分子量618.74） 美國Sigma公司。

RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；722分光光度計 上海第三分析儀器廠；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；開放式層析柱30mm×500mm 青島博陽儀器有限公司；PHS-3C雷磁精密pH計 上海精密儀器有限公司；T6紫外光譜掃描儀 北京普析通用儀器有限責任公司；JA2003電子天平 上海象平儀器儀表有限公司；TGL-16G高速離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗樣品 選購了11種以黑龍江地區篤斯越橘為原料的產品，其中7種果汁、1種原漿、3種果醬。產品的主要信息見表1。

1.2.2 篤斯越橘產品花色苷粗提物制備 量取一定量的篤斯越橘產品（果汁取20m L，果醬取10g，果漿取20m L），分別按照料液比1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16加入60%的乙醇溶液，提取溫度40℃、提取時間60m in。將經過離心、抽濾、減壓濃縮后得到的不同料液比的溶液定容到相同的體積，測定吸光值[7]。吸光值最大的確定為最佳料液比。

根據產品規格取一定量產品，按最佳料液比浸提收集濾液。濾渣按同樣的提取條件重復浸提兩次，至篤斯越橘產品浸提液為無色或淺褐色。3次所得濾液合并后于50℃下減壓濃縮得到棕紅色的粗提液[8]。

1.2.3 AB-8大孔樹脂對花色苷粗提物的純化 預處理過的AB-8大孔樹脂[9]采用濕法上柱，用5%鹽酸溶液洗2h后用蒸餾水水洗至中性，用5%NaOH堿溶液洗2h，再用蒸餾水水洗至中性，備用。花色苷粗提物以10m L/m in的流速通過層析柱，吸附至飽和后平衡吸附4h。用三倍柱體積的蒸餾水洗滌雜質，用pH 2的70%乙醇洗脫液進行洗脫，洗脫流速為1m L/m in[8]，收集所有紅色顏色的洗脫液（洗脫量大于95%）。洗脫液在50℃條件下減壓濃縮，定容。

1.2.4 純化篤斯越橘產品花色苷含量的測定

1.2.4.1 最大吸收波長 取1m L的花色苷純化液用9m L pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋，以1m L蒸餾水代替花色苷加9m L pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋作為參比[10]，采用紫外-可見光掃描儀于200～800nm下全波長掃描，確定其最大吸收波長為測定波長。

1.2.4.2 花色苷含量的計算 采用pH示差法，取1m L花色苷濃縮液，分別用pH1.0和pH4.5的緩沖液[11]稀釋到一定倍數，混勻。以1m L溶劑代替樣液作空白，分別在最大波長X和700nm處測定吸光值[12]。做3次平行實驗。總花色苷的含量（以矢車菊色素-3-葡萄糖苷計）按下式計算：

式中，V：代表純化液的總體積，m L；Mw：代表矢車菊色素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2mg/mol；Df：代表稀釋因子（樣品總的稀釋倍數）；ε：代表矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900moL-1；l：代表光程，1cm；v：代表產品體積，m L；蒸餾水作參比；用A700nm來消除樣液渾濁的影響。

1.2.5 抗氧化活性測定

1.2.5.1 對·OH清除能力的測定 采用水楊酸法測定花色苷對·OH的清除能力[13]。花色苷濃度為10、20、30、40、50、60μg/m L。按照表2添加藥品，最后加H2O2啟動反應，37℃反應0.5h，以蒸餾水作參比，在最大波長下測定各濃度的吸光度。每一吸光值平行測3次，取其平均值。抗壞血酸作陽性對照。

式中，A0：代表對照液的吸光度；A1：代表加入花色苷溶液后的吸光度；A2：代表不加顯色劑H2O2花色苷溶液的吸光度（花色苷本底值）。

1.2.5.2 對DPPH·清除能力的測定 花色苷對DPPH·清除能力的測定采用分光光度法[14-15]。所用DPPH·溶液濃度為2×10-4mol/L（95%的乙醇溶解），分別取不同濃度的花色苷溶液2m L及2m L DPPH·溶液加入同一具塞試管中，搖勻后放置30min，以乙醇作參比，分別測定517nm處的吸光度A1。同時測定2m L不同濃度花色苷溶液與2m L乙醇混合后517nm的吸光度A2，再測定2m L DPPH·溶液與2m L乙醇混合液517nm的吸光度A3。將根據公式計算其抑制率。每一吸光值平行測3次，取其平均值。抗壞血酸作陽性對照。

表1 實驗樣品Table 1 Experimental samples

式中，A1：代表加測定溶液后DPPH·的吸光度；A2：代表測定溶液在測定波長的吸光度；A3：代表未加測定溶液時DPPH·的吸光度。

2 結果與分析

2.1 實驗樣品花色苷提取條件的最適料液比

隨著料液比的增加，花色苷的吸光值增大，趨于平緩后又降低。當幾組料液比的花色苷吸光值差異不顯著時，考慮到溶劑用量過大而造成浪費，本實驗選取的為溶劑用量較少的最適料液比。11種樣品花色苷提取液的最適料液比見表3。

表3的結果表示，不同篤斯越橘產品中花色苷的最適料液比不同。原因是產品中花色苷含量、產品加工工藝、產品狀態不同。因為產品與鮮果相比含水量及組織狀態不同，本實驗只對篤斯越橘產品的提取料液比進行了探究，提取時間60min、提取溫度40℃為本校實驗的研究結果，不再進行探究。

2.2 實驗樣品中花色苷含量的平均濃度

從表4可以看出花色苷含量較高的是果醬類產品，B3花色苷含量最高，A2花色苷含量最低。

篤斯越橘果汁產品中花色苷濃度范圍為15.820～ 44.370μg/m L，果醬（漿）產品中花色苷濃度范圍為69.254～119.027μg/m L。原漿C1的花色苷含量小于果醬B1、B2和B3，是因為篤斯越橘產品原漿并非含有百分之百的原果，果醬中除篤斯越橘外，無含花色苷的其他物質，采用pH示差法得出的結果為目標物中單體花色苷，原漿花色苷含量小于果醬，原因為產品加工、貯藏過程中花色苷存在狀態變化所致。參照表1和表4，性價比較好的產品是B3、B1及A7，性價比較差的是A2。

2.3 篤斯越橘花色苷精制物抗氧化活性評價

2.3.1 清除·OH的能力

2.3.1.1 澄清果汁產品中花色苷對·OH的清除率 由圖1可以看出，4種產品中提取的花色苷對·OH的清除率均高于VC，并且隨質量濃度增加其清除率增強。4種產品中，在有效濃度范圍10～60μg/m L內，A2對·OH的清除能力最好，A7對·OH清除能力最差。當花色苷濃度大于30μg/m L時，A 5和A1對·OH的清除能力相差不大。

圖1 澄清果汁類藍莓產品中花色苷對·OH的清除率Fig.1 The·OH scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.1.2 帶果粒的果汁產品中花色苷對·OH的清除率 由圖2可以看出，3種產品中提取的花色苷對·OH的清除率均高于VC，并且隨質量濃度增加其清除率增強。3種產品中，A6對·OH的清除能力最好。當花色苷濃度小于30μg/m L時，A3對·OH的清除能力較A4好，當花色苷濃度大于30μg/m L時，A3和A4對·OH的清除能力基本相當。

2.3.1.3 果醬（漿）產品中花色苷對·OH的清除率由圖3可以看出，4種產品對·OH的清除均高于VC，并且隨著質量濃度的增加其清除率提高。其中C1對· OH的清除能力最強。當花色苷濃度小于20μg/m L時，B1、B2和B3對·OH的清除率增強的較平緩。當花色苷濃度大于20μg/m L時，B3對·OH的清除能力最差，B1和B2的清除能力基本相當。

表2 對·OH清除率測定方法的試劑添加順序Table 2 The addition order of the reagent in·OH assay

表3 花色苷提取條件的最適料液比Table 3 Themost suitable solid-liquid ratio of anthocyanin extraction conditions

表4 實驗樣品中花色苷含量的平均濃度（平均值±標準差）Table 4 The average concentration of anthocyanins content in the experimental samples（mean±standard deviation）

圖2 帶果粒的果汁類產品中花色苷對·OH的清除率Fig.2 The·OH scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

圖3 果醬類產品中花色苷對·OH的清除率Fig.3 The·OH scavenging rateofanthocyaninsin blueberry jams

2.3.2 清除DPPH·的能力

2.3.2.1 澄清果汁產品中花色苷對DPPH·清除率 由圖4可以看出，4種產品隨花色苷濃度增加其對DPPH·的清除率也提高。4種篤斯越橘果汁中對DPPH·清除能力最差的是A5，清除能力較強的是A1和A2，A1和A2為同一廠家生產。當花色苷濃度小于10μg/m L時，4種果汁對DPPH·的清除率都比VC低，當花色苷的濃度大于10μg/m L時，A1和A2的清除率比VC高。

圖4 澄清果汁類產品中花色苷對DPPH·的清除率Fig.4 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in clarified blueberry juice

2.3.2.2 帶果粒的果汁產品中花色苷對DPPH·的清除率 由圖5可以看出，3種帶果粒的篤斯越橘果汁中，A4對DPPH·的清除能力最差。當花色苷的濃度小于5μg/m L時，3種果汁對DPPH·的清除能力均小于VC；當花色苷的濃度大于15μg/m L時，A6的清除能力最強，A3和VC的清除能力基本相當。

圖5 帶果粒的果汁類產品對DPPH·的清除率Fig.5 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry juice with full fruit

2.3.2.3 果醬（漿）產品中花色苷對DPPH·的清除率由圖6可以看出，隨著花色苷質量濃度的增加，4種產品對DPPH·的清除率也隨之增強，C1對DPPH·的清除能力最差。當花色苷的濃度小于5μg/m L時，4種產品對DPPH·的清除能力均小于VC；當花色苷的濃度大于20μg/m L，B2對DPPH·的清除能力均高于其他3種產品。從總體4種產品對DPPH·的清除率而言，B2、B3和C1對DPPH·的清除效果相差不大。

圖6 果醬類產品對DPPH·的清除率Fig.6 The DPPH·scavenging rate of anthocyanins in blueberry jams

2.3.3 篤斯越橘產品花色苷清除·OH和DPPH·能力半數抑制濃度（IC50） 清除能力分別以花色苷提取物和VC標準品對·OH和DPPH·的清除率達到50%時對應的濃度IC50值表示，結果見表5。

表5 篤斯越橘產品花色苷提取物清除·OH和DPPH·能力半數抑制濃度表Table 5 The IC50 of the anthocyanins in blueberry products in ·OH and DPPH·assay

·OH IC50值比較：VC＞B3＞A3＞A4＞B1＞A 7＞B2＞A5＞A6＞A1＞C1＞A2；DPPH·IC50值比較：A4＞A5＞A7＞

C1＞B2＞B1＞A3＞A2＞B3＞A1＞VC＞A6。由結果比較可以看出，11種篤斯越橘產品的花色苷提取液對·OH的清除能力均比VC強，A4、A5、A7、C1、B2、B1、A3、A2、B3、A1對DPPH·的清除能力較VC弱，是由于抗氧化機理不同造成的。從IC50值的大小可以看出，同種產品對·OH的清除能力比DPPH·弱。不同的藍莓產品類型與IC50關系不明顯。

2.4 花色苷濃度和抗氧化評價方法之間的相關性研究

2.4.1 花色苷濃度與·OH清除率之間的相關性 由表6可以看出，11種篤斯越橘產品的花色苷提取液及VC標準溶液的濃度與·OH清除率之間的R2均大于0.9，呈顯著的正相關性。花色苷對·OH清除率與花色苷含量的相關性分析濃度為5～60μg/m L。

表6 花色苷濃度與·OH清除率的相關性Table 6 The correlation between anthocyanins contentand the·OH scavenging rate

2.4.2 花色苷濃度與DPPH·清除率之間的相關性 由表7可以看出，11種篤斯越橘產品的花色苷提取液及VC標準溶液的濃度與DPPH·清除率之間的R2均大于0.8，呈顯著的正相關性。花色苷對DPPH·清除率與花色苷含量的相關性分析濃度為2～20μg/m L。

表7 花色苷濃度與DPPH·清除率之間的相關性Table 7 The correlation between anthocyanins contentand the DPPH·scavenging rate

3 結論

篤斯越橘產品的抗氧化活性研究結果表明，11種篤斯越橘產品花色苷都具有抗氧化活性，可以有效清除DPPH·及·OH。11種篤斯越橘產品中提取的花色苷的抗氧化能力和其花色苷的濃度之間存在著明顯的量效關系，且在不同的抗氧化體系中相同濃度下的不同產品的花色苷則表現出不同的抗氧化活性。根據本實驗室的研究結果，篤斯越橘經過加工后，與原果相比抗氧化能力降低；不同產品相同濃度花色苷抗氧化活性不同，說明花色苷結構受到加工及環境條件的影響，但總體抗氧化能力降低較少。

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Assessment of the antioxidant activity of anthocyanins from V.uliginosum berry products

WU Jie1，ZHENG Ying1，GU Si-yun2，WANG Ping2，*，LIU Xiao-na2
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The antioxidantac tivity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts were analyzed.Firstly，the anthocyanins in V.uliginosum berry p roducts were extracted w ith 60%ethanol，and then separated by an AB-8 macroporous resin column and the pH d ifferential assay was used to determ ine the total anthocyanins content.Finally，the·OH assay and DPPH·assay were used to determ ine and compare the antioxidant capacity and the regular pattern of the V.uliginosum berry p roducts.The result showed that antioxidant capacity of the anthocyanins had a significant positive correlation w ith the anthocyanins content.The jam s had the largest anthocyanins content and the antioxidant capacity of anthocyanins in d ifferent V.uliginosum berry p roducts that was d ifferent.In·OH assay，the least IC50was 8.83μg/m L，and the largest was 43.24μg/m L.In DPPH·assay，the least IC50was 10.48μg/m L，and the largestwas 20.40μg/m L.

V.uliginosum berry p roducts；anthocyanins；antioxidant capacity

TS255.1

A

1002-0306（2012）22-0181-05

2012－05－11 *通訊聯系人

吳杰（1990-），女，大學本科，研究方向：食品基礎原料開發。

東北林業大學創新實驗基金（1110225012）。