傳統發酵酸牛奶中乳酸菌多態性分析

魏冉冉，方 偉，霍貴成

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

傳統發酵酸牛奶中乳酸菌多態性分析

魏冉冉，方 偉，霍貴成*

（東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150030）

以從內蒙古呼倫貝爾市牧區采集的1份傳統發酵酸牛奶樣品為研究對象，對其進行乳酸菌的分離鑒定。通過傳統純培養法分離出17株菌，并對17株菌進行16S rDNA序列分析、多位點pheS序列分析和生理生化鑒定，鑒定的結果為11株乳酸乳球菌乳酸亞種、1株格式乳球菌、1株糞腸球菌、2株植物乳桿菌植物亞種及2株彎曲乳桿菌。乳酸乳球菌乳酸亞種為優勢菌（占總分離菌株的64.7%）。

酸牛奶，乳酸菌，多態性

內蒙古地區牧民長期飲用的酸牛奶，就是以鮮牛奶為原料，未經任何處理在自然環境中發酵而成的乳制品。發酵的過程不需要商品發酵劑，而是用前一天的酸奶做天然發酵劑接種到新鮮的奶中使其自然發酵成酸奶，其味清酸爽，開胃增食，是農牧民野外、農耕、放牧的理想食品。常和奶油混合用來拌炒米或其他米飯吃。如加入少許白糖，夏季尤為酸甜可口，為牧區夏季日常飲用食品之一[1]。由于其是自然發酵，未經任何處理，因此其微生態環境未遭破壞，而且由于它特殊的制作方法使其形成了自己的特色，使其中的乳酸菌的生物學特性和基因多樣性得到了很好的保留，因此這些豐富的乳酸菌資源有待于開發和利用。對這些乳酸菌進行分離鑒定和生物學特性的研究，對傳統乳制品中乳酸菌種類的認識、推動乳酸菌的基礎研究以及開發應用地域特色的乳酸菌制品都有重要意義。本研究以從內蒙古呼倫貝爾市牧區采集的1份傳統發酵酸牛奶樣品為研究對象，對其中的乳酸菌多樣性進行了研究，不僅能夠研究牧區獨特自然發酵乳中微生物區系組成，而且能為進一步開發利用內蒙古自治區牧民自制酸牛奶中的乳酸菌奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樣品 采自內蒙古呼倫貝爾市牧民家庭自制的1份傳統發酵酸牛乳；乳酸菌富集用加富的脫脂乳培養基 10%脫脂乳、0.5%蛋白胨、0.25%酵母粉、1%葡萄糖[2]；分離培養 采用MRS培養基分離乳酸桿菌和M 17培養基分離乳酸球菌[3]；做生理生化實驗所用的各種糖發酵實驗的培養基 均為青島海博有限公司生產的細菌微量生化反應管。

光學顯微鏡（OLMPUS）、蒸汽滅菌器、恒溫培養箱、超凈工作臺、PCR儀，凝膠成像儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集 采集牧民家庭中的傳統發酵酸牛乳于滅菌管中，并封好放入冰盒內，帶回實驗室于4℃冰箱中保存備用。

1.2.2 乳酸菌的分離、純化與保存 樣品→富集培養→涂布（稀釋度為10-5、10-6）→挑取可疑菌落→液體培養基培養→平板劃線分純（分純三次）→純培養物→革蘭氏染色（G+）；過氧化氫實驗（-）→甘油保存（-80℃）（50%的甘油，菌液∶甘油為6∶4）。

1.2.3 菌株基因組DNA小量提取 取1m L MRS或M 17液體培養物（過夜培養或培養24h），10000r/m in離心1m in，收集菌體。采用天根公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。提取的DNA置于-20℃保存。提取的DNA作為16S rDNA序列分析，多位點pheS序列分析的樣品。

1.2.4 16S rDNA序列分析 利用引用通用引物27F和1541R[4-5]對菌株的16S rDNA片段進行擴增，正向引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物為1541R：5’-AAGGAGGTGATTCCAGCC-3’。

擴增條件如下：94℃預變性5m in；30個循環：94℃變性1m in，58℃退火1m in，72℃延伸2m in；72℃末端延伸10m in，然后將擴增成功的產物直接送華大純化和測序。參比序列采用乳酸菌已知模式菌株的16S rDNA序列（這些序列從GeneBank中獲?。6]。序列的對比和系統發育樹的構建都通過Mega 4軟件（Tamura，et al，2007）[7]完成。系統發育樹的構建采用鄰比法[8]和maximum composite likelihood model模型。自展分析基于1000次重復。

1.2.5 pheS基因序列分析[9]利用引物pheS-21-F和pheS-23-R對菌株的pheS基因序列片段進行擴增，正向引物為pheS-21-F：5’-CAYCCNGCHCGYGAYATGC-3’，反向引物為pheS-23-R：5’-GGRTGRACCATVCC NGCHCC-3’。

擴增條件如下：94℃預變性5m in；30個循環：94℃變性1min，46℃退火1min 15s，72℃延伸1min 15s；72℃末端延伸7m in，然后將擴增成功的產物直接送華大純化和測序。參比序列采用乳酸菌已知模式菌株的pheS（這些序列從GeneBank中獲?。Ｐ蛄械膶Ρ群拖到y發育樹的構建都通過Mega 4軟件完成。系統發育樹的構建采用鄰比法和maximum composite likelihood model模型。自展分析基于1000次重復。1.2.6 乳酸菌的生理生化鑒定 鑒定乳酸乳球菌，需要做40℃生長實驗、4%NaCl生長實驗、pH 9.2生長實驗和糖發酵實驗。糖發酵實驗利用細菌微量生化反應管，將活化好的菌液離心后，用生理鹽水重新懸浮，注入管內，再放入滅菌大試管中，37℃培養一周后觀察結果。實驗鑒定結果均參照《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[10]、《伯杰細菌鑒定手冊》[11]、《常見細菌系統鑒定手冊》[12]的標準進行判定，確定其屬種。

2 結果與討論

2.1 各菌株16S rDNA序列分析

各菌株的序列分析結果總結在樹狀圖中（見圖1）。

菌株KLDS 6.1101與糞腸球菌（Enterococcus faecalis）系統發育關系最為密切，有99.9%的16S rDNA序列相似性。因而菌株KLDS 6.1101可以初步鑒定為糞腸球菌（Enterococcus faecalis）。

圖1 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.1 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

圖2 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.2 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

菌株KLDS 4.1112與格式乳球菌（Lactococcus garvieae）系統發育關系最為密切，有99.9%的16S rDNA序列相似性，因而菌株KLDS 4.1112可以初步鑒定為格式乳球菌（Lactococcus garvieae）。由此樹狀圖可以看出乳酸乳球菌形成單一的DNA同源群，但是按照表型特征足可以將它們分為三個亞種，它們是Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.hordniae和Lactococcus lactis subsp.lactis。菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111屬于乳酸乳球菌，它們與Lactococcus lactis subsp.cremoris、Lactococcus lactis subsp.hordniae、Lactococcus lactis subsp.lactis的16S rDNA序列相似性都在99%以上。本實驗的結果也說明了很難通過16S rDNA全序列測定的方法將它們區分出來，因此它們進一步的分離可以根據生理生化實驗的結果。

菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102屬于植物乳桿菌（L.p lantarum）組，與Lactobacillus p lantarum subsp. argentoratensis、Lactobacillus pentosus、Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum、Lactobacillus parap lantarum和Lactobacillus fabifermentans系統發育關系密切，分別有99.6%、99.7%、99.6%、99.7%和99.0%的16S rDNA序列相似性，可以初步鑒定為植物乳桿菌（L.p lantarum），其確切的分類地位還需要其他分類學方法才能確定。

圖3 基于16S rDNA序列的樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA alignment

菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104屬于彎曲乳桿菌（L.curvatus）組，與Lactobacillus fuchuensis、Lactobacillus graminis、Lactobacillus sakei 和Lactobacillus curvatus系統發育關系密切，分別有98.0%、99.4%、99.0%和99.6%的16S rDNA序列相似性，除了Lactobacillus fuchuensis外，菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104與其他三個菌種的16S rDNA序列相似性都很高，菌株KLDS 1.1103和KLDS 1.1104可以初步鑒定為彎曲乳桿菌（L.curvatus），其確切的分類地位還需要其他分類學方法才能確定。

2.2 pheS基因序列分析

菌株KLDS 1.1101和KLDS1.1102與Lactobacillus p lantarum subsp.argentoratensis、Lactobacilluspentosus、Lactobacillus p lantarum subsp.plantarum、Lactobacillus paraplantarum、Lactobacillus fabifermentans的16S rDNA序列相似性都很高，因此在16S rDNA序列分析的基礎上，通過pheS基因序列進一步對菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102的分類地位進行確定。

圖4 基于pheS基因序列樹狀圖Fig.4 Phylogenetic tree based on the pheSgene alignment

菌株KLDS 1.110和KLDS 1.1102與Lactobacillus p lantarum subsp. argentoratensi、 Lactobacillus pentosus、Lactobacillus plantarum subsp.plantarum、Lactobacillus parap lantarum 和 Lactobacillus fabifermentans分別有90%、80.3%、100%、89.5%和77.7%pheS序列相似性，因此菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102鑒定為植物乳桿菌植物亞種（Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum）。

2.3 乳酸乳球菌生理生化鑒定結果

乳酸菌種的鑒定主要是分離菌株對碳水化合物的發酵產酸實驗，即通過對單糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇類等碳水化合物的利用情況來區分[10-12]。對于某些球菌還有pH 9.2、4%NaCl和40℃的生長實驗。對菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111進行生理生化鑒定，鑒定項目和結果如表1所示，11株乳酸乳球菌能發酵半乳糖、乳糖、麥芽糖和核糖，不能發酵松三糖、蜜二糖和棉籽糖，能在pH 9.2、4%NaCl和40℃條件下生長，其結果和《乳酸菌分類鑒定及實驗方法》[10]、《伯杰細菌鑒定手冊》[11]、《常見細菌系統鑒定手冊》[12]中描述的乳酸乳球菌乳酸亞種的生理生化結果一致，因此將11株菌鑒定為乳酸乳球菌乳酸亞種。

3 結論

3.1 從傳統發酵酸牛奶中分離和純化了17株乳酸菌，對這17株乳酸菌進行16S rDNA全序列分析，可以初步將這些菌株鑒定為以下乳酸菌種：11株乳酸乳球菌、1株格式乳球菌、1株糞腸球菌、2株植物乳桿菌和2株彎曲乳桿菌。

表1 乳酸乳球菌的生理生化鑒定結果Table 1 Identification results of physiological and biochemical test of lactococcus lactis

3.2 對菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102的確切的分類地位通過pheS序列分析進行了確定，可將菌株KLDS 1.1101和KLDS 1.1102鑒定為植物乳桿菌植物亞種。用16S rDNA全序列分析和生理生化相結合將菌株KLDS 4.1101、KLDS 4.1102、KLDS 4.1103、KLDS 4.1104、KLDS 4.1105、KLDS 4.1106、KLDS 4.1107、KLDS 4.1108、KLDS 4.1109、KLDS 4.1110、KLDS 4.1111鑒定到亞種，這些菌株均為乳酸乳球菌乳酸亞種。

3.3 內蒙古傳統發酵酸牛奶中的乳酸菌種類和數量有所不同，呈現出多樣性，其中乳酸乳球菌乳酸亞種為優勢菌占總分離菌的64.7%，可能正是它們賦予了酸牛奶特殊的風味和質地。

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[12]東秀珠.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京：科學出版社，2001.

Diversity analysis of lactic acid bacteria isolated from the traditional fermented m ilk

WEIRan-ran，FANGW ei，HUO Gui-cheng*
（Key Laboratory of Dairy Science，Ministry of Education，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China）

17 isolates of lactic acid bac teria（LAB）were isolated from the trad itional fermented m ilk gathering from the herdmen’s home in Hulunbeier of Inner Mongolia by traditional pure culture method.Based on 16S rDNA sequence analysis，pheS sequence analysis and physiological and biochem ical test，these isolates were identified as 11 strains of Lactococcus lactic.subsp.lactic，1 strain of Lactococcus garvieae，1 strain of Enterococcus faecalis，two strains of Lactobacillus p lantarum subsp.p lantarum and 2 strains Lactobacillus curvatus.Lactococcus lactic.subsp.lactic was the p redom inant strain（64.7%of the total isolates）.

fermented m ilk；lactic acid bacteria；d iversity

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0210-04

2012－05－21 *通訊聯系人

魏冉冉（1986-），女，碩士研究生，研究方向：乳品科學與微生物。

“乳酸菌代謝調控與發酵劑制造技術”教育部長江學者和創新團隊發展計劃資助（IRT0959）。