重組過氧化物酶A4-Prx酶學特性及其降解DDGS中ZEN的研究

吳 暉，肖俊梅，陳 藝，余元善，陳深亮，唐語謙，*

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640；

2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東廣州 510610）

重組過氧化物酶A4-Prx酶學特性及其降解DDGS中ZEN的研究

吳 暉1，肖俊梅1，陳 藝1，余元善2，陳深亮1，唐語謙1，*

（1.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510640；

2.廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東廣州 510610）

初步研究了一種重組過氧化物酶Acinetobacter sp.SM04（A4-Prx）的酶學特性，并先對pH、溫度和H2O2濃度對過氧化物酶A4-Prx活性的影響進行單因素優化，然后采用正交實驗設計對A4-Prx降解玉米酒糟中玉米赤霉烯酮的反應條件進行了優化。結果表明，重組過氧化物酶A4-Prx不含有血紅素，其過氧化物酶活性的最適pH、溫度和H2O2濃度分別為pH8.5、75℃、25mmol/L；A4-Prx降解DDGS中ZEN的最佳反應條件為：H2O2濃度40mmol/L，料液比1∶2（g/mL），溫度70℃，時間9h，且在該條件下ZEN降解率為99.2%±0.2%。

過氧化物酶，酶學特性，ZEN，DDGS，生物降解，正交實驗

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN，ZEA），又名F-2雌性毒素，是世界上污染范圍最廣的一種鐮刀霉毒素，其性質穩定，難降解[1-3]。玉米及其副產品極易受ZEN污染[4-5]。王金榮等對玉米酒糟DDGS（dried distillers’grains and soluble）多個樣品調查結果顯示，ZEN的陽性檢出率均為100%，ZEN含量范圍為4.79～1219.90μg/kg，超出國家標準（玉米中ZEN含量≤60μg/kg）5～20倍以上，其對DDGS為飼料的禽畜危害深遠[6-8]。生物轉化脫毒ZEN技術能避免物理和化學方法的去毒效果有限、營養物質損失大、成本高和有害物質殘留等缺點，已成為研究熱點和主要趨勢[9-10]。日本Takahashi-Ando等對粉紅粘帚霉（Clonostachys rosea）的研究較為全面，分離出的內酯水解酶zhd101可破壞ZEN結構，使其轉化為雌激素毒性較弱的化合物，且ZEN的降解率在80%～90%之間[11-12]。大腸桿菌和釀酒酵母表達的重組zhd101表現出了內酯水解酶的能力，對ZEN的降解率可達75%[13-14]，具有zhd101的轉基因玉米也具備降解ZEN的能力[15]。此外，奧地利Molnar從白蟻后腸中分離出了一種新酵母菌—毛孢子菌屬Trichosporon mycotoxinivorans，它的培養物能將ZEN降解為二氧化碳和其他弱紫外吸收的代謝物，從而降低其毒性[16]；Abdullah從玉米地里分離的假單胞菌ZEA-1可利用ZEN為唯一碳源，并且在12h內可將ZEN減少一半[17-18]，編碼此ZEN降解酶的基因在大腸桿菌中也獲得了活性表達[18]。本課題組成員從Acinetobacter sp.SM 04培養物上清液中分離到一種有降解ZEN功能的過氧化物酶[19]，并且克隆了其基因在大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中獲得了活性表達[20]。本文在此基礎上，對此重組過氧化物酶A4-Prx的酶學特性進行研究，并且探索了A4-Prx在DDGS中對ZEN降解的最優條件，從而為綜合開發利用DDGS提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

重組大腸桿菌E.coli BL21/pET31b/A4-Prx 本實驗室構建保存；DDGS樣品（ZEN含量約2000μg/kg）

廣州郊區農貿市場收購；氨芐青霉素和IPTG（異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷） 廣州翔博生物科技有限公司；30%H2O2水溶液 上海潤捷化學試劑有限公司；酵母浸膏、胰蛋白胨、氯化鈉 廣州環凱微生物科技有限公司；甲醇、乙腈 天津啟輪化學科技有限公司，色譜純。

Waters高效液相色譜儀、2745熒光檢測器 美國Waters公司；恒溫氣浴、水浴搖床 江蘇蘇昆儀器有限公司；N2蒸發儀 美國Organomation Associates公司；真空旋轉蒸發儀 上海圣葉科技儀器有限公司；PuriToxSR TC-M 160真菌毒素多功能凈化柱 北京泰樂琪科技有限公司；高速冷凍離心機 Eppendorf公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 A4-Prx酶液的制備 接種重組大腸桿菌BL21/pET31b/A4-Prx于LB培養基中（含50μg/m L氨芐青霉素），置于搖床培養（37℃，250r/m in）。待OD600值為0.5時，添IPTG，使其終濃度為0.5mmol/L，繼續培養4h。離心收集細胞（10000×g，5m in）。用15m L，50mmol/ L的Tris-HCl緩沖液體（pH9.0）重懸，用超聲波細胞破碎儀破碎細胞（4℃，200W，15m in），離心收集上清液（10000×g，5min）。

1.2.2 A4-Prx的酶學特性研究 以過氧化物酶活力測定方法[21]，測定不同pH、溫度和H2O2濃度下A4-Prx酶活。血紅素的含量采用吡啶高鐵血紅素法分析[21]。1m L吡啶-H2O-NaOH溶液（0.2mol/L NaOH溶液∶吡啶= 3∶2，體積比）和20μL 0.1mol/L鐵氰化鉀[K3Fe3（SCN）6]溶液混合均勻后，添加1m L A4-Prx酶液，漩渦混合1m in，紫外可見分光光度計測定549.5nm處的吸光值。1m L A4-Prx酶液和1m L去離子水混合作為參比對照。

1.2.3 A 4-Prx降解DDGS中ZEN的條件優化 通過研究H2O2濃度、作用時間、溫度和料液比對降解玉米酒精糟中ZEN的影響等單因素實驗后，設計4因素3水平正交實驗[22]，見表1，優化A4-Prx降解DDGS中ZEN的條件。選取H2O2濃度、作用時間、溫度和料液比DDGS∶A4-Prx四個因素，設計9組不同組合實驗，從中篩選出最佳降解條件。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 DDGS中ZEN的降解實驗 2g DDGS樣品中加0.3m L 2%（v/m）Na2CO3水溶液，再添加9m L A4-Prx酶液（料液比實驗酶液需成倍增加），置于恒溫培養箱中孵育6h后，加入2m L 0.1mol/L Tris-HCl（pH 9.0）及15m L乙腈，常溫旋渦振搖10m in，濾紙過濾。用PuriToxSR TC-M 160真菌毒素多功能凈化柱過濾5m L濾液，收集流出液體3m L于60℃下N2蒸發儀蒸干后用500μL流動相溶解，溶解液用于高效液相色譜（HPLC）分析檢測ZEN的殘留量。HPLC條件：色譜柱采用Waters XTerraR MSC18柱（4.6×150mm，5μm）；流動相為水∶乙腈∶甲醇=46∶46∶8；柱溫30℃；流量1m L/m in；進樣量30μL；結果采用熒光檢測器，激發波長270nm，發射波長450nm[20]。設置對照組中，使用去離子水代替酶液。結果以相對降解率表示，計算公式如下：

相對降解率（%）=處理后DDGS中ZEN的含量（μg/kg）/對照組DDGS中ZEN的含量（μg/kg）×100

2 結果與討論

2.1 A4-Prx的酶學特性研究結果

圖1 不同pH對A4-Prx活力的影響（50℃）Fig.1 Effectof pH on the activity of A4-Prx（50℃）

圖2 不同溫度對A4-Prx活力的影響（pH8.5）Fig.2 Effectof temperature on the activity of A4-Prx（pH8.5）

圖3 不同H2O2濃度對A4-Prx活力的影響（50℃，pH8.5）Fig.3 Effectof H2O2 concentration on the activity of A4-Prx（50℃，pH8.5）

不同pH、溫度和H2O2濃度對重組過氧化物酶A4-Prx酶活的影響結果分別見圖1～圖3。研究結果表明，在中性及酸性條件下，A4-Prx的活力較低，堿性條件下，A 4-Prx有較強的活力，最高可達138U/m L，其最適pH為8.5；從30℃開始，A4-Prx的活力隨著溫度的升高而增加，至75℃時達到最大，而后隨著溫度的升高開始降低，其最適溫度為75℃；H2O2濃度在0～ 20mmol/L范圍內，A4-Prx活力隨其升高而增大，當H2O2濃度為20mmol/L時，其活力最大可達168U/m L，A4-Prx活力在H2O2濃度大于20mmol/L時有微弱降低，但是也穩定在130U/m L。

2.2 DDGS中ZEN降解條件的單因素實驗

2.2.1 料液比對ZEN降解的影響 固定降解時間6h，H2O2濃度20mmol/L，溫度40℃，分別選取料液比（g/m L）為1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5進行ZEN降解實驗，結果見圖4。由圖4可知，A4-Prx酶液用量增加，有利于ZEN降解。但當料液比超過1∶2后，ZEN降解率增加并不明顯，且用量過大會增加后續工藝的難度，能耗較高。因此從經濟角度考慮，最適料液比為1∶2，且后續實驗都采用此比例。

圖4 不同料液比對ZEN降解效果的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratios on ZEN degradation

2.2.2 時間對ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），溫度40℃，H2O2濃度20mmol/L，分別選取降解時間1、3、6、9、12、15、18h進行ZEN降解實驗，結果見圖5。由圖5可知，當反應時間為9h時，ZEN降解率約為80%；隨著時間增加，ZEN降解率最終保持平衡，為了提高實驗效率，綜合選取9h為ZEN降解反應最適時間。

圖5 不同反應時間對ZEN降解效果的影響Fig.5 Effectof reaction times on ZEN degradation

2.2.3 H2O2濃度對ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），時間9h，溫度40℃，分別選取H2O2濃度10、20、30、40、50、60mmol/L進行ZEN降解實驗，結果見圖6。由于H2O2是A4-Prx氧化降解ZEN的必要成分，一定濃度的雙氧水能促進ZEN降解[20]，在10～ 30mmol/L范圍內，隨著H2O2濃度增大，ZEN降解率逐漸升高，當H2O2濃度超過30mmol/L時ZEN的降解率開始下降至穩定，這與上述A4-Prx酶活受H2O2濃度影響結果一致，因此H2O2最佳濃度為30mmol/L。

圖6 不同H2O2濃度對ZEN降解效果的影響Fig.6 Effect of H2O2 concentrations on ZEN degradation

2.2.4 溫度對ZEN降解的影響 固定降解料液比為1∶2（g/m L），降解時間9h，H2O2濃度40mmol/L，分別選取反應溫度30、40、50、60、70、80、90℃進行ZEN降解實驗，結果見圖7。在30～60℃范圍內，隨著溫度逐漸增升高，ZEN降解率變大，當溫度為60℃時，ZEN的降解率最大可達60%。溫度達到80℃時，A4-Prx活力開始受到抑制[21]，ZEN的降解率開始降低。故ZEN降解最佳溫度為60℃。

圖7 不同反應溫度對ZEN降解效果的影響Fig.7 Effectof temperatures on ZEN degradation

2.3 正交法優化降解條件的實驗

通過上述單因素實驗，按照表1中數據進行L9（34）正交實驗，所得結果見表2、表3。

表2正交實驗結果表明，隨著這四個因素值的增大，ZEN降解率增大，且影響DDGS中ZEN降解率因素的主次順序為作用時間＞H2O2濃度＞溫度＞料液比，即在一定范圍內，作用時間對ZEN降解率影響最大，其次是H2O2濃度、溫度，料液比影響最小。正交實驗結果表明，A4-Prx對ZEN降解的最佳因素組合為：料液比1∶2（g/m L）、時間9h、H2O2濃度40mmol/L、溫度70℃。按照最佳實驗條件重復3次ZEN降解實驗。結果測得ZEN降解率可達99.2%±0.2%。

表3列出了各因素方差平方和，它反映了正交實驗中四個因素自身水平變化時所引起的結果差異，即各個因素對結果的影響，其中作用時間方差平方和最大，即它對ZEN降解影響最大；由于各因素方差平方和的大小與項數有關，不能確切反映各因素的情況，為了消除項數對結果的影響，表3中四個因素的均方結果也驗證了作用時間為影響ZEN降解的主要因素，其次為H2O2濃度、溫度、料液比；F值的大小反映了各因素對實驗結果影響程度的大小，結果也顯示ZEN降解影響強弱順序為：作用時間＞H2O2濃度＞溫度＞料液比。由表3可知，在DDGS的ZEN降解實驗中，作用時間、H2O2濃度、溫度三個因素對ZEN降解率的影響最為顯著，料液比對ZEN降解率的影響顯著性較弱。所以在ZEN降解中，要控制好作用時間、H2O2濃度、溫度。

表2 優化DDGS中ZEN降解正交試驗方案設計及結果Table 2 The orthogonal design for ZEN degradation optimization in DDGS

表3 方差分析表Table 3 ANOVA analysis

3 結論與討論

國家標準GB 13078.2-2006中規定配合飼料中ZEN的最高檢出限為0.5mg/kg[26]；GB 2761-2011中規定食品（玉米、小麥）中的ZEN最高檢出限為60μg/kg[27]。但是，王若軍等[23-25]均報道飼料廠ZEN陽性檢出率高達80%。此外，伴隨著燃料乙醇工業的巨大增長，世界各國玉米產量也在迅速增長[28]。玉米生產酒精過程中產生的DDGS，因其融入了糖化曲和酵母的營養成分和活性成分，是近年來在畜禽飼養上應用較多的高蛋白、高營養飼料原料之一[8]。由于DDGS中殘留有較高含量ZEN，并且危害畜禽的生長及繁殖性能[7]，從而帶來一定的經濟損失。因此，建立一種經濟、可行的方法來解決DDGS中ZEN污染問題勢在必行。

近年來，關于ZEN生物脫毒技術的研究取得了一定的進展。ZEN可以被細菌、酵母菌及其他真菌等降解成為α和β玉米赤霉烯醇和其他代謝產物，但是它們仍然存在雌激素毒性，所以并不是真正意義上的脫毒[29]。然而，重組過氧化物酶A4-Prx已被證實有降解ZEN毒素的功能，并且可以將ZEN完全轉化為無毒產物[19-20]。在前期研究基礎上，本論文探究了A4-Prx酶學特性，并且優化了影響DDGS中ZEN降解率的條件。結果表明，A4-Prx的酶活受pH、溫度和H2O2濃度的影響，且最適pH8.5、最適溫度75℃、最適H2O2濃度25mmol/L。目前，大多數過氧化物酶均具有血紅素依賴性，包括辣根過氧化物酶、大豆過氧化物酶、木質素過氧化物酶等，而其最適pH多在5左右，而A4-Prx的最適pH為8.5，并且它屬于非血紅素依賴的過氧化物酶。另外，A4-Prx降解DDGS中ZEN的最佳工藝條件組合為：H2O2濃度40mmol/L，料液比1∶2（g/m L），溫度70℃，時間9h。在此工藝條件下，DDGS中ZEN的降解率可達到99.2%，降解率比優化前提高了19%左右。A4-Prx氧化降解DDGS中ZEN毒素更徹底，且條件溫和、對飼料的營養成分破壞更少，因此，它為ZEN污染飼料以及飼料原料的脫毒實現工業化奠定了基礎，也將促進ZEN脫毒技術研究的發展。

[1]Labuda R，Parich A，Berthiller F，et al.Incidence of trichothecenes and zearalenone in poultry feedmixtures from Slovakia[J].International Journal of Food Microbiology，2005，105：19-25.

[2]Zinedine A，Soriano JM，MoltóJC，et al.Review on the toxicity，occurrence，metabolism，detoxification，regulations and intake of zearalenone：an oestrogenic mycotoxin[J].Food and Chemical Toxicology，2007，45：1-18.

[3]Abid-Essefi S，Ouanes Z，Hassen W，et al.Cytotoxicity inhibition of DNA and protein syntheses and oxidative damage in cultured cells exposed to zeaealenone[J].Toxicology in Vitro，2004，18：467-474.

[4]Bothast R J，Schlicher M A.Biotechnological processes for conversion of corn into ethanol[J].Appllied Microbiology and Biotechnology，2005，67（1）：19-25.

[5]張丞，劉穎莉.2006年飼料和原料中霉菌毒素調查總結報告[J].飼料廣角，2007（9）：23-26.

[6]謝林，呂西軍.玉米酒精生產新技術[M].北京：中國輕工業出版社，2001.

[7]王照群，戴求仲.玉米DDGS對家禽的營養價值及應用[J].飼料博覽，2011（9）：9-11.

[8]王金榮，馬鵬，黃亞寬，等.2010年上半年DDGS常規養分含量差異及霉菌毒素污染狀況調查[J].飼料工業，2011，32（17）：61-64.

[9]王金昌，涂祖新，王小紅，等.玉米赤霉烯酮的毒害及脫毒技術的研究進展[J].江西科學，2008，26（2）：251-273.

[10]熊凱華，程波財，胡威，等.玉米赤霉烯酮降解的研究進展[J].中國糧油學報，2010，25（1）：138-142.

[11]Kimara M，Naoko T，Nishiu-chi T.Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of fusarium mycotoxin contamination [J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2006，86（3）：117-123.

[12]El-Sharkawy S，Abul-Hajj Y.Microbial cleavage of zearalenone[J].Xenobiotica，1988，18：365-371.

[13]Naoko T，Shuichi O，Takehiko S，et al.Metabolism of zearalenone by genetically modified organisms expressing the detoxification gene from clonostachys rosea[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology，2004，70：3239-3245.

[14]Naoko T，KimuraM，Kakeya H，etal.A novel lactonohydrolase responsible for the detoxification of zearalenone：enzyme purification and genecloning[J].Journal of Biochemistry，2002，365：1-6.

[15]Tomoko I，Naoko T，NoriyukiO，etal.Reduced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology，2007，73（5）：1622-1629.

[16]Molnar O，Schatzmayr G，Fuchs E，et al.Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov，a new yeast species useful in biological detoxification of various mycotoxins[J].Systematic and Applied Microbiology，2004，27：661-671.

[17]Abdulla D Altalhi.Plasmid-mediated mycotoxin zearalenone in Pseudomonas putida ZEA-1[J].Am JBiotech Biochem，2007（3）：150-158.

[18]AbdullaDAltalhi，Bahig El-Deeb.Localization ofzearalenone detoxification gene（s）in pZEA-1 plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1 and expressed in Escherichia coli[J].JHazard Mater，2009，161：1166-1172.

[19]Yu Yuanshan，Qiu Liping，Wu Hui，et al.Degradation of zearalenone by the extracellular extracts of Acinetobacter sp. SM04 liquid culture[J].Biodegradation，2011（22）：613-622.

[20]Yu Yuanshan，Wu Hui，Tang Yuqian，et al.Cloning，Expression of a peroxiredoxin gene from Acinetobacter sp.SM04 and characterization of its recombinant protein for zearalenone detoxification[J].Microbiol Res，2012，167（3）：121-126.

[21]Jun Ogawa，Woro Triarsi Sulistyaningdyah，LiQing-Shan，et al.Two extracellular proteins with alkaline peroxidase activity，a novel cytochrome c and a catalase-peroxidase from Bacillus sp. No.13[J].Biochimica et Biophysica Acta，2004，1699：65-75.

[22]張娜，陳錦屏，嚴靜，等.和田玉棗總皂甙超聲提取工藝[J].食品科學，2011，32（2）：108-110.

[23]王若軍，苗朝華，張振雄.中國飼料及飼料原料受霉菌毒素污染的調查報告[J].飼料工業，2003，23（7）：53-54.

[24]敖志剛，陳代文.2006-2007年中國飼料及飼料原料霉菌毒素污染調查報告[J].中國畜牧獸醫，2008，35（1）：152-156.

[25]張丞，劉穎莉．2009年上半年中國飼料及原料霉菌毒素污染情況[J].中國禽業導刊，2009，25（19）：40-41.

[26]GB 13078.2-2006飼料中赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮的允許量[S].北京：中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會，2006.

[27]GB 2761-2011食品安全國家標準：食品中真菌毒素限量[S]．北京：中華人民共和國衛生部，2011.

[28]曹冬梅.美國DDGS及中國北方玉米中的霉菌毒素檢測[J].飼料廣角，2010（24）：24-25.

[29]Karlovsky P.Biological detoxification of fungal toxins and its use in plantbreeding，feed and food production[J].Nat Toxins，1999：1-23.

Study on characterization of a recombinant peroxidase A4-Prx and its ZEN detoxification in DDGS

WU Hui1，XIAO Jun-mei1，CHEN Yi1，YU Yuan-shan2，CHEN Shen-liang1，TANG Yu-qian1，*
（1.College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；
2.Sericulture and Agro-food Research Institute，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510610，China）

The enzymatic characteristics of the recombinant peroxidase Acinetobacter sp.SM 04（A4-Prx）was stud ied.Firstly，the effec t of pH，tem perature and H2O2concentration on peroxidase A4-Prx activity were stud ied.Then，the orthogonal experiment was designed to receive the op timal ZEN（zearalenone）deg radation rate of A4-Prx in DDGS（d ried distillers’grains and solub le）.The A4-Prx characterization result showed that it was an alkaline and p rotoheme independent peroxidase，and the op timal pH value，tem perature and H2O2concentration for peroxidase A4-Prx activity were pH8.5，75℃ and 25mmol/L respectively.And the op timum cond ition for ZEN decontam ination were as follows：40mmol/L H2O2，9h，70℃ and 1∶2（solid-liquid ratio，g/m L）. Under the op timum cond ition，ZEN deg radation rate was 99.2%±0.2%.

peroxidase；enzymatic characteristics；zearalenone；DDGS；biodetoxification；orthogonalexperiment

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0213-05

2012－04－10 *通訊聯系人

吳暉（1967-），男，博士，教授，研究方向：食品質量與安全。

廣東省大學生創新實驗項目（S1010561065）；華南理工大百步梯攀登計劃研究項目（DA2091015）；華南理工大學2012“學生研究計劃”（SRP）；國家自然科學基金項目（31201330）。