Aspergillus niger C15產柚苷酶發酵條件的優化研究

李志堅，譚興和，李高陽

（1.湖南省農產品加工研究所，湖南長沙 410125；

2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙 410128）

Aspergillus niger C15產柚苷酶發酵條件的優化研究

李志堅1，譚興和2，李高陽1

（1.湖南省農產品加工研究所，湖南長沙 410125；

2.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙 410128）

通過正交實驗對黑曲霉菌株C15產柚苷酶的發酵條件進行了優化。實驗結果表明，Aspergillus niger C15菌株的最優產酶發酵條件為：2%桔皮粉、6%豆粕粉，250mL三角瓶中裝料30mL，接種量3%，最適初始pH為5.0，30℃條件下培養100h，產酶量可達1395.9U/mL。與原始產酶條件相比，產酶量提高8.6%。不同的金屬離子對產酶有不同的作用，添加適量的K2HPO4、MgSO4對產酶有明顯的促進作用，CuSO4、FeSO4對產酶起抑制作用。

柚苷酶，黑曲霉，條件優化

就柑桔汁而言，產品出現的過度苦味是柑桔加工業所面臨的嚴重問題[1-3]。柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的一組復合酶系[4]，能水解柑桔中的主要苦味物質柚皮苷成為無苦味的柚配質、鼠李糖和葡萄糖[5]。最初柚苷酶是Hall[6]從芹菜種子中分離得到的，它能在一定條件下將柚皮苷分解而苦味消失。后來Ting S V[7]在一些利用真菌發酵生產的果膠酶制劑中也發現并分離出這種酶，同時還發現用這種酶處理柚子汁可導致其總黃酮的含量會明顯減少。胡奎等[8]從堆積腐爛柑桔的土壤中分離得到產柚苷酶的曲霉SN-90系，郭倩等[9]通過在腐爛的柚子皮上收集的天然菌株經過分離初篩獲得產柚苷酶菌株。賴崇德等[10]則以桔皮粉作為唯一的碳源和氮源，從腐爛的桔皮上分離出一株產柚苷酶菌株A166，酶活力可達到955.6U/m L。由于酶法脫苦具有專一、高效、快速、對果汁風味和營養成分無影響等特點，已成為目前最理想的脫苦方法[7，11-12]。但目前應用酶法脫苦還存在著高產菌株缺乏、產酶效率低、成本高等問題。國內還沒有工業化生產的商品柚苷酶制劑，只有日本等少數發達國家有工業化生產，而且價格昂貴，在生產實踐中使用進口柚苷酶將會使企業生產成本大大增加。以上原因導致柚苷酶在柑桔深加工中的應用受到了極大的限制，因此篩選柚苷酶高產菌株、生產高品質的柚苷酶商品酶制劑已成為當務之急。本文以從自然界篩選得到的一株產柚苷酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger C15為出發點，較為系統地研究了接種量、發酵溫度、碳氮源、培養基初始pH、發酵時間等因素對菌株產柚苷酶的影響，通過正交實驗對C15菌株產柚苷酶的發酵培養基組成及發酵工藝條件進行了優化，旨在獲得柚苷酶發酵的最佳條件，為進一步工業化生產柚苷酶提供理論和技術依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉Aspergillus niger C15 本實驗室分離篩選獲得，酶活1285.6U/m L；柚皮苷（99.8%）、鼠李糖（99%） 鄭州荔諾生物科技有限公司；葡萄糖、蔗糖、乳糖、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2、CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、NH4H2PO4、MnSO4·4H2O

國藥集團化學試劑有限公司，分析純；蛋白胨、酵母膏 上海市寶典化工有限公司；豆粕粉、麩皮、米糠、淀粉 市售；桔皮粉 自制，過80目篩，柚皮苷含量經HPLC檢測約為6.3%。

全溫振蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠；高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特公司；LC-20A液相色譜儀 SHIMADZU株式會社島津制作所；精密pH計 梅特勒-托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 搖瓶發酵培養基制備 豆渣（含水40%）10%，豆粕4%，葡萄糖2%，柚皮苷0.02%，自然pH，加水至1000m L，250m L三角瓶裝液量30m L，0.1MPa蒸汽滅菌20m in。

1.2.2 發酵培養 將菌種斜面孢子活化后制成1×106個/m L孢子懸液，然后接種到搖瓶發酵培養基，置于振蕩培養箱（30±1）℃培養3d。

1.2.3 粗酶液的制備 取搖瓶培養物1m L，以3000r/m in離心20m in，所得的上清液即為粗酶液。

1.2.4 柚苷酶酶活測定方法 取2m L 0.1%柚皮苷標準溶液和0.2mol/L、pH 4.0醋酸緩沖液1.9m L置于試管中，在40℃恒溫水浴中預熱4～5m in，然后加入粗酶液0.1m L，充分搖勻，準確保溫30m in后，加熱至100℃使酶失活，離心取上清液，經0.45μm濾膜過濾，用液相色譜儀測定柚皮苷含量。柚苷酶活力的定義為：在溫度為40℃、pH 4.0條件下，每分鐘每毫升酶液分解柚皮苷的微克數[5]。

1.2.5 不同接種量對產酶的影響 分別以1%、3%、5%、7%、9%、11%的接種量接種到搖瓶培養基中，以恒溫30℃、180r/m in的轉速條件下搖床培養。每個接種量進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.6 不同發酵溫度對產酶的影響 以上述實驗具有最高酶活的接種量接種到搖瓶培養基中，分別以20、25、30、35、40℃等不同的發酵溫度條件下，以恒溫30℃、180r/min的轉速搖床培養。每個發酵溫度做三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.7 不同碳源對產酶的影響 選擇葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麩皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖11種不同碳源以2%的添加量添加到搖瓶培養基中，以30℃、180r/m in搖瓶培養，每種碳源進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.8 不同氮源對產酶的影響 分別以豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）28種不同含氮物質作為氮源分別以4%的添加量添加到搖瓶培養基中以30℃、180r/min的條件搖瓶培養，每種氮源進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.9 添加無機鹽的種類對產酶的影響 分別以0.1%的添加量添加CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO4到搖瓶培養基中充分溶解后于30℃、180r/min搖瓶培養，并以未加入上述無機鹽發酵液的酶活作為對照。每種無機鹽進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.10 培養基初始pH對產酶的影響 在搖瓶培養基組成和其他條件不變的情況下分別調節培養基pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0在30℃、180r/m in條件下搖瓶培養，每個pH進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。

1.2.11 裝液量對產酶的影響 分別將20、30、40、50、60m L不同量的液體培養基分別加入到250m L三角瓶中，在30℃、180r/m in條件下進行搖瓶培養，每個裝液量進行三次平行實驗，72h后測酶活，取平均值。1.2.12 發酵時間的選擇 以1.2.5具有最高酶活的接種量接種到搖瓶培養基中，在溫度30℃、180r/min、自然pH條件下搖床培養。每隔12h測發酵液酶活及水溶性蛋白含量。

1.2.13 產酶條件的優化 選擇桔皮粉用量、豆粕粉用量、發酵溫度、發酵時間作為因素進行L9（34）正交實驗設計，因素水平表見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal experiment

2 結果與分析

2.1 不同接種量對產酶的影響

不同接種量對產酶的影響見圖1。實驗結果表明，當接種量較低時，酶活性較低，可能是由于所形成菌絲體密度不夠，不利于酶的生成；但當接種量增加到5%時，酶活性也較低，則可能是由于培養基中營養物質不能充分滿足菌體生長，導致形成的菌絲體較細小，同時散熱比較慢，所產生的廢氣也不易排出，不利于酶的形成。從圖1中可看出，當接種量為3%時，發酵液中的酶活達到最高，與其他接種量差異極顯著，由此可確定，3%即為最合適的接種量。

圖1 不同接種量對產酶的影響Fig.1 Effect of starter amounton naringinase productivity

2.2 不同發酵溫度對產酶的影響

在發酵系統中保持穩定而合適的溫度環境是保證酶活性的重要條件。本實驗研究了在20、25、30、35、40℃等不同的發酵溫度對產酶的影響，結果見圖2。

圖2 不同發酵溫度對產酶的影響Fig.2 Effect of temperature on naringinase productivity

由圖2可知，在溫度范圍20～30℃時，隨著溫度的升高，產酶活性迅速上升，當溫度到達30℃時，酶活達到最大值1156.4U/m L，與其他各個溫度差異較顯著，溫度偏高或偏低都不利于產酶。溫度升高，反應速率加大，生長代謝快，生產期提前，但菌體容易衰老，發酵周期縮短，從而影響酶的最終產量。其次，溫度過高還可能導致柚苷酶性質不穩定甚至失活。溫度過低，繁殖周期加長，菌體總量較低，直接影響酶的產量。由此可確定，菌株的最適產酶溫度為30℃。

2.3 不同碳源對產酶的影響

選擇11種不同碳源：葡萄糖、蔗糖、桔皮粉、麩皮、米糠、柚皮苷、葡萄糖+柚皮苷（3+1）、蔗糖+柚皮苷（3+1）、淀粉、鼠李糖、乳糖，添加到搖瓶培養基中，用量均為2%，進行搖瓶發酵，測發酵液中柚苷酶的活力。不同碳源對菌株產柚苷酶的影響結果見圖3。

圖3 不同碳源對菌株產柚苷酶的影響Fig.3 Effectof different carbon sources on naringinase productivity

從圖3可以看出，以桔皮粉和蔗糖+柚皮苷作為碳源最有利于產酶，葡萄糖+柚皮苷、鼠李糖次之，且與其他碳源差異極顯著。可能是由于葡萄糖效應的存在，以葡萄糖+柚皮苷作為碳源時的酶活較蔗糖+柚皮苷低。以麩皮、米糠、淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖等作為單一碳源時，發酵液中柚苷酶的酶活很低，這說明柚苷酶在液態發酵條件下須在誘導物如柚皮苷的誘導下才能產生。實驗同時發現柚皮苷的水解產物鼠李糖對柚苷酶的形成也有一定的誘導作用，但柚皮苷的誘導作用更好，此實驗結果與張晨等[13]的研究結果吻合。由此可見柚苷酶底物的誘導作用較產物的誘導作用更強。由于柚皮苷價格較昂貴，而桔皮粉是一種廉價易得復雜的有機物質成分，除含有起關鍵誘導作用的柚皮苷外還含有豐富的糖類及少量有利于微生物生長的粗蛋白和礦質元素，作為碳源不僅可以大大減少酶的生產成本，而且產柚苷酶與以蔗糖+柚皮苷作為碳源相當，故選擇桔皮粉作為菌株產柚苷酶的最佳碳源。

2.4 不同氮源對產酶的影響

研究表明，發酵過程中應對氮源的種類和濃度進行嚴格控制，盡量避免不適當的氮源及濃度對菌體生長和酶的形成產生負面影響。選擇8種不同氮源（豆粕粉、蛋白胨、酵母膏、（NH4）2SO4、（NH4）2HPO4、NH4NO3、NH4Cl、CO（NH2）2）分別添加4%到搖瓶培養基中進行搖瓶發酵，測發酵液中柚苷酶的活力，結果見圖4。

圖4 不同氮源對菌株產酶的影響Fig.4 Effectof various nitrogen sources on naringinase productivity

由圖4可以看出，在幾種不同的氮源中，以豆粕粉作為氮源時酶活最高，其次為硝酸銨和硫酸銨。其中豆粕粉是一種廉價易得的氮源，除含豐富的蛋白質和氨基酸外，還含有一些適合微生物生長繁殖的碳水化合物如低聚糖和大量維生素如維生素E等，另外還含有一些對產酶有明顯促進作用的礦質元素如Mg2+等，因此，選擇豆粕粉作為菌株發酵培養基的氮源。

2.5 添加無機鹽的種類對產酶的影響

選擇CaCl2、ZnSO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、NaNO3、NaCl、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、K2HPO49種無機鹽分別以0.1%的添加量添加到搖瓶培養基中進行實驗，測定發酵液酶活，并以未加入上述無機鹽的發酵液的酶活作對照。結果見表2。

實驗結果表明，在所選擇的幾種無機鹽中，K2HPO4、MgSO4·7H2O兩種無機鹽則對產酶具有明顯的促進作用，可能是由于K+和Mg2+作為多種酶的激活劑，在酶與底物結合時起橋梁作用從而促進了酶的產生；ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O對產酶有明顯的抑制作用，可能是由于Zn2+、Fe2+等金屬離子與酶結合后改變了酶的空間構象，抑制了酶的活性，也可能是由于培養基中這幾種金屬離子濃度已能充分滿足菌體生長和產酶，額外添加則導致濃度過高從而抑制的酶的產生；CaCl2、NaNO3、NaCl和MnSO4·4H2O對產酶的影響不明顯。

表2 無機鹽種類對產酶的影響Table 2 Effectof inorganic salton the naringinase production

2.6 不同發酵液初始pH對產酶的影響

微生物在生長過程中會不斷地消耗碳源和氮源，同時也會造成培養基pH發生變化。而酶的產生需要一個合適的pH范圍。霉菌有著極強的繁殖能力[14]，對生長和產酶的pH范圍較寬，一般在3.0～8.5之間變動。在搖瓶培養基組成和其他條件不變的情況下用檸檬酸或氨水調節培養基到不同的pH（3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）進行搖瓶發酵，測定發酵液中柚苷酶的活力，不同初始pH對產酶的影響結果見圖5。

圖5 不同初始pH對產酶的影響Fig.5 Effectof initial pH on naringinase productivity

大多數菌種有維持其體內細胞酸堿度在近中性條件的能力，有利于菌體進行正常的新陳代謝。但發酵液的pH將會對菌株的產酶反應有間接的影響。由圖5可以看出，在pH 3.0～5.0時，隨著pH的上升，酶活迅速增加；在pH 4.5～5.5范圍內，酶活保持在較高水平，達1000U/m L以上，并在pH為5.0時達到最高峰，為1167.4U/m L，與其他pH差異較為顯著。由pH6.0～8.0，酶活呈下降趨勢。由此可見，pH偏高或偏低都不利于菌體產酶，因此確定發酵培養基起始pH為5.0。

2.7 裝液量對產酶的影響

分別將20、30、40、50、60m L不同量的液體培養基分別加入到250m L三角瓶中，進行搖瓶培養，測發酵液中柚苷酶的活力。培養基占搖瓶體積比對產酶的影響見圖6。

圖6 不同裝液量對產酶的影響Fig.6 Effectof differentmedium contained in flask on naringinase productivity

由圖6可知，250m L三角瓶中裝液量為30m L時，柚苷酶酶活最高，為1146.3U/m L。由此可見，該菌株產柚苷酶對培養基中氧含量要求較高，隨著裝液量的上升，酶活開始下降，這可能是由于裝液量過多導致搖瓶內的剩余空間變小，培養基中的溶氧量相應減少，抑制了菌絲體的生長和酶的形成。當裝液量小于30m L時，酶活較高，但在實際操作中若裝液量過少，如小于20m L時，不便于粗酶液的提取而且導致效率降低，生產成本增加。綜合考慮以上因素，本實驗選取最適裝液量為250m L三角瓶裝液量30m L。

2.8 發酵時間的選擇

將所篩選菌株進行搖瓶發酵，并在發酵過程中不同時間取樣，測定發酵液中的柚苷酶的活力和水溶性蛋白質含量，發酵液的變化情況見圖7。

圖7 發酵時間對產酶的影響Fig.7 Effectof fermentation time on naringinase productivity

由圖7可知，菌株在培養基中發酵產酶，柚苷酶活性的高峰出現時間為連續培養100h前后，酶活達1123.2U/m L，此時水溶性蛋白含量也達到了最高，為0.41mg/g，說明菌體也獲得了最大限度的生長。本實驗以取得最大產量的柚苷酶為目標，因此發酵周期定為100h，可得到最佳產柚苷酶活力。

2.9 產酶條件的優化

采用L9（34）正交實驗對菌株產酶條件進行優化，實驗結果見表3。對表3進行直觀分析發現，組合2即A1B2C2D2柚苷酶活力最高。從極差值R看出：各因素影響柚苷酶活力主次順序為發酵溫度＞豆粕粉用量＞發酵時間＞桔皮粉用量。綜合分析發現，A1B3C2D2為最優培養基組成，即桔皮粉2%、豆粕粉6%、發酵溫度為30℃、發酵時間為100h菌株產柚苷酶能力最佳。利用DPS統計軟件對實驗結果進行方差分析，結果見表4。由表4可知，各個因素的顯著性順序依次為：C＞B＞D＞ A，因素B、C、D均達到了顯著水平（p＜0.05），A因素的作用不顯著。由于A1B3C2D2組合不在實驗之列，故需要再進一步作驗證實驗。

表3 正交試驗表L9（34）Table 3 L9（34）orthogonal test

表4 正交試驗方差分析結果Table 4 Resultof orthogonal experiment variance analysis

2.10 驗證實驗

按正交實驗得到的最優組合A1B3C2D2，即桔皮粉2%、豆粕粉6%，發酵溫度為30℃、發酵時間為100h（培養基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，接種量為3%，發酵液初始pH為5.0，250m L三角瓶中裝液量為30m L）進行驗證實驗，平行做三份，實驗結果分別為1397.2、1408.5、1382.1U/m L，三個平行實驗的柚苷酶活力平均值1395.9U/m L較表3中酶活力值最高的組合2即A1B2C2D2有小幅度提高，說明該最優組合工藝合理可行。

3 結論

采用單因素實驗和正交實驗設計相結合的實驗方法，對柚苷酶產生菌的產酶條件進行了優化，得到了Aspergillus niger C15菌株的最優產酶發酵條件，其組成為：2%桔皮粉、6%豆粕粉，培養基中添加0.1%K2HPO4和0.1%MgSO4·7H2O，250m L三角瓶中裝料30m L，接種量3%，最適初始pH為5.0，30℃條件下培養100h，產酶量可達到1395.9U/m L。與優化前產酶條件相比，產酶量提高8.6%。通過實驗充分證明了不同的金屬離子對產酶具有不同的作用，適量添加K2HPO4、MgSO4·7H2O對產酶有促進作用，而ZnSO4、FeSO4·7H2O和CuSO4·5H2O則對產酶起抑制作用，生產過程中應盡量避免使用含有此類對產酶產生抑制作用離子的容器。

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[14]霉菌[EB/OL].http：//baike.baidu.com/view/36020.htm.

Study on the optimum fermentation conditions of
Aspergillus niger C-15 for the production of naringinase

LIZhi-jian1，TAN Xing-he2，LIGao-yang1
（1.Hunan Agricultural Product Processing Institute，Changsha 410125，China；
2.College of Food Science and Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China）

The fermentation cond itions for Aspergillus niger C15 naringinase p roduc tion were op timalized by orthogonal experiment.The experimental result ind icated that the best fermentation conditions was as follows：2%citrus peelmealand 6%soybean meal，30m L culture media in 250m L beaker flask，3%inoculation amount，initial pH 5，incubation tem perature 30℃，time 100h.Under these op tim ized cond itions，the yielding capacity of naringinase by the mutant was 1395.9U/m L，which was increased by 8.6%com pared w ith the initial level（1285.6U/m L）.Proper quantity of K2HPO4and MgSO4could imp rove naringinase p roduction，CuSO4，FeSO4were bad for p roducing enzyme.

naringinase；Aspergillus niger；op tim ization

TS201.3

A

1002-0306（2012）20-0229-05

2012－01－05

李志堅（1977-），男，碩士，助理研究員，研究方向：農產品加工及貯藏。

國家863計劃項目（2007AA10Z307）。