赤蘚糖醇高產菌選育及發酵條件研究

溫擁軍，游玟娟，羅躍中，謝達平

（1.湖南化工職業技術學院，湖南株洲 412004；

2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

赤蘚糖醇高產菌選育及發酵條件研究

溫擁軍1，2，游玟娟1，羅躍中1，謝達平2

（1.湖南化工職業技術學院，湖南株洲 412004；

2.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙 410128）

為了提高赤蘚糖醇的產量，對自選耐高滲酵母菌T-3-2進行紫外線與亞硝酸復合誘變處理，并采用響應曲面法優化了其發酵條件。復合誘變得到1株穩定高產突變株UN-11，其赤蘚糖醇的產量達到78.3mg/mL，比T-3-2提高了38.8%；通過響應面分析建立了關鍵影響赤蘚糖醇產量的二次多項式數學模型，得到最佳生產工藝條件為：發酵溫度31℃、轉速170r/min、接種量9.8%。模型預測結果產物濃度達到84.93mg/mL，驗證實驗結果產物濃度為85.25mg/mL。該模型對赤蘚糖醇工業化生產有一定的指導意義。

赤蘚糖醇，耐高滲酵母，紫外線，復合誘變，響應曲面法

赤蘚糖醇是一種國際上較為流行的新型甜味劑，它主要存在于藻類、蘑菇等真菌類生物，甜瓜、葡萄等水果以及葡萄酒、醬油等各類發酵食品中，同時它在人體的血液、精液、尿液中也有一定的含量[1-3]。其具有低熱值、口感好、低吸濕性、無致齲齒性、不易出現變褐現象等優點[4-6]。因此在食品工業，醫藥保健及化妝品等行業均有廣闊的應用前景[7]，但長期以來赤蘚糖醇行業受困于成本高、價格昂貴，嚴重限制其應用范圍。目前，赤蘚糖醇的工業化生產唯一方法是微生物發酵法，在微生物發酵生產中影響產物產量的主要因素是菌種和發酵條件。近年來，國內外學者對此進行了大量研究，劉鵬等[8]篩選得到一株赤蘚糖醇產生菌E54，其產量為41.1g/L；劉鳳珠等[9]通過紫外誘變獲得一株產赤蘚糖突變C1，其產量為24.9g/L；董海洲等[10]對Torulopsis sp.ERY237發酵條件進行優化，在最佳條件下赤蘚糖醇產量可達87.8g/L。總的來說，我國對赤蘚糖醇生產的研究系統化程度低，產量不高，工業化進程較慢。如何進一步提高菌種性能，優化發酵條件，提高赤蘚糖醇產量，將是今后研究的重點。本研究以自選耐高滲酵母（osmotolerant yeast T-3-2）為出發菌株，經紫外線與亞硝酸復合誘變，得到一株穩定高產突變株UN-11，通過對發酵條件進行優化，使赤蘚糖醇的產量大幅度提高，旨在通過降低生產成本，提高其市場競爭力，擴大其應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

耐高滲酵母（osmotolerant yeast T-3-2） 由本實驗組從蜂巢中分離得到；斜面培養基 PDA培養基；固體平板培養基 葡萄糖50%，酵母膏0.5%，瓊脂2%，pH6.0；發酵培養基 葡萄糖30%，玉米漿0.8%，CuSO4·5H2O 0.05%，MnSO4·4H2O 0.5%，pH自然。

HPS-250生化培養箱 哈爾濱東明醫療儀器廠；CBV-1500A超凈工作臺 上海瑞仰凈化裝備有限公司；QYC.2102搖床 上海福瑪實驗設備有限公司，LDZ4-0.8A離心機 北京醫用離心機廠；HH.SYHNi2-C水浴鍋 北京長源實驗設備廠；UV-9100紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外及亞硝酸誘變方法 參照游玟娟等[11]實驗方法進行，誘變菌株經培養后，挑取菌落較大且厚的菌株，編號并接入試管斜面保藏，同時取對應的菌株接種到250m L搖瓶（裝液量為50m L）中，置于30℃，180r/m in搖床培養5d，測定發酵液的赤蘚糖醇含量。

1.2.2 發酵條件優化方法 采用單因素實驗，分別研究發酵溫度、發酵時間、搖床轉速、接種量、裝液量及起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響。在此基礎上，運用Box-Behnken設計進行響應曲面優化，找到最佳發酵條件。BBD實驗設計的因素及水平如表1所示。

表1 BBD響應面設計的因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

1.2.3 赤蘚糖醇測定方法 采用袁野等[12]高碘酸氧化法測定。

2 結果與分析

2.1 紫外線誘變篩選結果

紫外線誘變得到結果如表2所示。由表2可知，經過紫外線誘變后，部分菌株赤蘚糖醇產量下降，如UV-2、UV-6、UV-16、UV-20等，同時也發現大部分菌株的赤蘚糖醇產量都有所提升，如UV-9、UV-11、UV-13、UV-14、UV-17、UV-19菌株產量都達到了60mg/m L以上，其中UV-13菌株赤蘚糖醇產量最高，達到68.4mg/m L。相對于出發菌株T-3-2，UV-13產赤蘚糖醇的能力提高了21.3%。

表2 紫外線誘變后菌株的赤蘚糖醇產量Table 2 Erythritol yield after UV mutagenesis

2.2 亞硝酸誘變篩選結果

對菌株UV-13再進行亞硝酸誘變處理，得到結果如表3。由表3可知，經亞硝酸誘變后，赤蘚糖醇的產量進一步提高，紫外線與亞硝酸有較好的協同性。絕大部分菌株赤蘚糖醇產量是提高的，其中菌株UN-11赤蘚糖醇產量的為78.3mg/m L，相對于UV-13提高了11.4%，即為本實驗得到的目的菌株。

表3 亞硝酸誘變后菌株的赤蘚糖醇產量Table 3 Erythritol yield after nitritemutagenesis

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 發酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響

發酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響如圖1所示。由圖1可知，溫度對赤蘚糖醇產量有顯著影響。當溫度低于30℃時，赤蘚糖醇產量隨溫度升高而逐漸增加；溫度超過30℃時，隨溫度升高赤蘚糖醇產量反而降低；當發酵溫度為30℃，赤蘚糖醇產量最高，達到81.4mg/m L。其原因是溫度會影響酵母菌的生長，溫度過低則酵母細胞生長過慢，溫度過高則細胞生長旺盛，影響了產物的積累；而且溫度過高，會增加能耗，從工藝角度看會增加生產成本，所以，發酵溫度宜選30℃。

圖1 發酵溫度對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.1 Effectof temperature on erythritol yield of UN-11

2.3.2 發酵時間對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響按實驗方法測得不同發酵時間對赤蘚糖醇產量的影響如圖2所示。由圖2可知，發酵時間在96～192h內，隨著時間的延長，赤蘚糖醇產量增加，但超過144h后，增速減緩。原因是赤蘚糖醇在細胞內合成途徑復雜，其合成與生長速度不一致，有明顯的“滯后性”。從工藝角度上講，發酵時間選144h為較好。

2.3.3 轉速對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響 不同轉速對赤蘚糖醇產量的影響，結果如圖3所示。

圖2 發酵時間對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.2 Effectof time on erythritol yield of UN-11

圖3 轉速對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.3 Effectof revolution on erythritol yield of UN-11

由圖3可以看出，轉速對赤蘚糖醇產量影響顯著。當轉速180r/m in時，赤蘚糖醇產量最高，為81.5mg/m L。由于酵母菌合成赤蘚糖醇是好氧過程，轉速主要影響發酵液的溶氧量，在120～180r/min內，增加轉速則溶氧量增加，有利于酵母的生長。但轉速過快，會產生過大的剪切力，損傷細胞而導致產量下降。因此，確定最佳轉速為180r/m in。

2.3.4 接種量對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響 從圖4可知，接種量對赤蘚糖醇產量有顯著影響。當接種量＜10%的范圍內，接種量與赤蘚糖醇產量呈正相關。接種量＞10%后，則隨接種量增加，產量反而下降。可能是因為過大的接種量會使得發酵前期菌體生長過旺，導致繁殖代數偏少，使得老化細胞所占比例增大，影響赤蘚糖醇在細胞中的積累。在工藝角度來看，適當增加接種量，能縮短生產周期，但接種量過大則會增加制備種子液的成本，并引起產量下降。因此宜選接種量為10%。

圖4 接種量對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.4 Effectof inoculum concentration on erythritol yield of UN-11

2.3.5 裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響 不同裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響如圖5所示。

圖5 裝液量對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.5 Effectof medium volume on erythritol yield of UN-11

裝液量主要影響的也是發酵的溶氧量，由圖5可知，隨著裝液量的增多，單位體積赤蘚糖醇的產量越來越少，但赤蘚糖醇的總產量則是隨著裝液量的增加，先升高后降低，當裝液量為100m L時，總產量達到8020mg/瓶，為最大值。因此，裝液量宜選100m L。

2.3.6 起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響不同起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響如圖6所示。由圖6可以看出，起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產量影響不顯著，當起始pH處于4～7范圍內時，赤蘚糖醇的產量較高，當起始pH等于6時，赤蘚糖醇產量為82.9mg/m L，達到最大值。在起始pH為8赤蘚糖醇的產量最低，為78.4mg/m L。產生這種結果的原因是真菌最適pH為弱酸性，當超過這個范圍時，菌體生長受到影響，甚至不能生長，故起始pH應選擇6。

圖6 起始pH對菌株UN-11赤蘚糖醇產量的影響Fig.6 Effectof pH value on erythritol yield of UN-11

2.4 Box-Behnken設計與結果

在單因素實驗的基礎上，選取對赤蘚糖醇產量影響較顯著的3個因素作為考察對象，即溫度（X1）、轉速（X2）、接種量（X3）。其他因素控制在各自最佳水平。根據Box-Behnken設計的原理，利用M initab軟件設計一個3因素3水平共15個實驗點的實驗設計，所得結果如表4所示。

以赤蘚糖醇產量為響應值，用Minitab 15.0軟件對實驗結果進行多元回歸分析，所得結果如表5、表6所示。結果表明，模型在α=0.05水平上回歸顯著；失擬項p=0.157＞0.1，失擬不顯著。同時，一次項、平方項以及X2X3項均對響應值有顯著性影響。X1X2、X1X3交互項作用影響不顯著。

借助軟件中的回歸擬合，實驗因子X對響應值Y的影響可用回歸方程表示為：赤蘚糖醇產量Y= 84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3；決定系數R2為91.15%，模型擬合程度較好。求解得到最佳條件為發酵溫度X1=30.59℃、轉速X2=169.5r/min、接種量X3=9.78%，模型預測結果為84.93mg/m L。考慮到操作可行，將最佳條件修約為發酵溫度X1=31℃、轉速X2=170r/m in、接種量X3=9.8%。在此條件下進行驗證，赤蘚糖醇的產量為85.25mg/m L，與預測結果基本吻合。說明該模型對赤蘚糖醇發酵生產有理論指導意義。轉速（X2）與接種量（X3）的三維響應面圖見圖7。由圖7可以知，當接種量控制在10.7%時，轉速在150～163.2r/m in范圍內，赤蘚糖醇的產量隨轉速的增大而增加。繼續增大轉速則產量反而下降。當轉速固定在163.2r/m in時，接種量對產量的影響也存在最大值，當接種量為10.7%，赤蘚糖醇的產量達到85.03mg/m L。

表4 BBD實驗設計及實驗結果Table 4 Box-Behnken design and experimental results

表5 模型的回歸分析Table 5 Regression analysis ofmodel

表6 模型的方差分析Table 6 Variance analysis ofmodel

圖7 Y=f（X2，X3）響應面立體分析圖Fig.7 3D analysis charta of y=f（X2，X3）

3 結論

采用紫外線與亞硝酸復合處理，通過篩選得到一株穩定高產突變株UN-11，其赤蘚糖醇的產量達到78.3mg/m L，比T-3-2提高了38.8%。對高產突變株UN-11的發酵條件進行了優化，運用Box-Behnken響應面技術建立了關鍵影響赤蘚糖醇產量的二次多項式數學模型：Y=84.23+3.71X1-1.9X2+1.71X3-6.29X12-2.37X22+4.49X32-2.18X2X3。得到最佳提取工藝為：發酵溫度X1=31℃、轉速X2=170r/m in、接種量X3=9.8%。模型預測結果產物濃度為84.93mg/m L，驗證實驗結果產物濃度達到85.25mg/m L。

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Study on breeding of high erythritol producing strain and fermentation condition

WEN Yong-jun1，2，YOUWen-juan1，LUO Yue-zhong1，XIE Da-ping2
（1.Hunan Chemical Industry Vocational Technology College，Zhuzhou 412004；
2.College of Bioscience and Biotechnology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）

In order to im p rove the yield of erythritol，the original strain osmotolerant yeast T-3-2 was treated by UV and HNO2，and its fermentation cond ition was op tim ized by sing le factor and response surface methodology（RSM）.A high and stab le yield mutant named UN-11 was ob tained.The erythritol yield of UN-11 was 78.3mg/m L，which increased 38.8%com pared w ith the original strain.The second-order polynom ial equation for erythritol yield was estab lished by response surface analysis theory.Op tim ized p rocessing cond itions obtained were fermentation tem perature of 31℃，rotate speed of 170r/m in and inoculation amount of 9.8%（v/v）. Under these op tim ized conditions，the p redic ted yield of fitted modelwas 84.93mg/m L and verifying test result was 85.25mg/m L.The modelhad some guid ing sense for erythritol industrialp roduction.

erythritol；Osmotolerant yeast；UV；com pound mutagenesis；response surface methodology（RSM）

TS201.3

A

1002-0306（2012）22-0242-04

2012－05－21

溫擁軍（1980－），男，碩士，講師，研究方向：微生物工程。