大孔樹脂純化紅松松球鱗片多酚及其抗氧化活性研究

李 波，包怡紅，高 鋒，王振宇，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；

2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研處，黑龍江哈爾濱 150086；

3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086）

大孔樹脂純化紅松松球鱗片多酚及其抗氧化活性研究

李 波1，2，包怡紅1，高 鋒3，王振宇1，*

（1.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；

2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科研處，黑龍江哈爾濱 150086；

3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150086）

通過吸附和解吸實(shí)驗(yàn)，從樹脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520中篩選出了適合純化紅松松球鱗片多酚的大孔樹脂，并確定純化工藝參數(shù)。結(jié)果顯示，AB-8樹脂為吸附分離紅松松球鱗片多酚類物質(zhì)的優(yōu)良材料，純化工藝條件為：上樣體積為0.3BV，上樣濃度為1.5mg/mL，上樣后靜態(tài)吸附3h，水洗3BV，洗脫劑為90%乙醇，洗脫劑用量為1.6BV。在此條件下，多酚的純度由12.51%提高到35.07%。同時(shí)對純化前后的抗氧化活性進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，紅松松球鱗片多酚經(jīng)純化后還原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力都強(qiáng)于粗提物。

大孔樹脂，純化，紅松松球鱗片，多酚，抗氧化活性

近年來研究發(fā)現(xiàn)松科植物體內(nèi)含有大量多酚類物質(zhì)，該類物質(zhì)具有抗氧化[1]、降血脂[2]、抗癌[3]、抗輻射[4]、抑菌消炎和抗病毒[5]等功能，可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、保健品及高分子材料等領(lǐng)域。我國的紅松資源豐富，但對其體內(nèi)多酚類物質(zhì)的研究還很少。紅松松球鱗片作為松子的副產(chǎn)物，常常被廢棄，因此有必要綜合開發(fā)利用該資源。紅松松球鱗片乙醇提取物中含有許多雜質(zhì)，為更好地對多酚類成分進(jìn)行研究，必須采取有效的方法純化提取物。大孔吸附樹脂作為一種高分子聚合物吸附劑，具有不溶于酸、堿及有機(jī)溶劑，對有機(jī)物選擇性好，不受無機(jī)鹽類低分子化合物存在的影響等優(yōu)點(diǎn)，近年來在天然產(chǎn)物分離純化方面應(yīng)用越來越廣泛。但應(yīng)用大孔樹脂純化紅松松球鱗片多酚的研究還未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)篩選了適合紅松松球鱗片多酚類物質(zhì)純化的樹脂，并對純化工藝進(jìn)行研究；同時(shí)對紅松松球鱗片多酚純化前后的抗氧化活性進(jìn)行了對比，以期為紅松松球鱗片多酚的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和綜合利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅松松球鱗片 收集于黑龍江省伊春林區(qū)；不同型號的大孔樹脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520 購于南開大學(xué)化工廠；DPPH Sigma公司；福林酚、無水碳酸鈉、無水乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、鐵氰化鉀、氯化鐵、三氯乙酸 均為國產(chǎn)分析純。

DFY-500搖擺式高速中藥粉碎機(jī) 溫州市大德中藥機(jī)械有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽、DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；SHB-ⅢG循環(huán)式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；FA2004電子天平 上海天平儀器廠；722可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HZS-HA水浴振蕩器 中國·哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司；FD-1E-50冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紅松松球鱗片多酚提取液的制備 紅松松球鱗片原料，自然晾干后粉碎過60目篩。稱取一定量的鱗片粉末，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的提取條件，加57%乙醇、液料比27∶1，80℃的恒溫水浴中浸提4h。浸提完成后迅速冷卻，抽濾除去不溶物，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇，制得一定濃度的提取液。

1.2.2 多酚含量（濃度）測定 采用福林酚法測定多酚含量[6]。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品對照計(jì)算樣品中多酚含量，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=3.7955C+0.02，式中，A表示吸光值；C表示沒食子酸濃度（mg/m L）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程可導(dǎo)出多酚含量的計(jì)算公式：

式中，N為稀釋倍數(shù)；A′為1m L稀釋液的吸光值。

1.2.3 樹脂的預(yù)處理與裝柱 樹脂預(yù)處理：大孔樹脂用95%乙醇充分浸泡24h后，乙醇洗滌，直至洗出液加適量水無白色混濁，再用蒸餾水洗至無醇味。然后用4%的鹽酸溶液浸泡3h，蒸餾水洗至中性，接著用5%的氫氧化鈉溶液浸泡3h，蒸餾水洗至中性，備用[7]。

裝柱：采用濕法裝柱。先在柱內(nèi)倒入一定量的蒸餾水，然后將預(yù)處理后的濕樹脂，沿著玻璃棒加入柱中。同時(shí)開啟柱底活塞，讓水從底部緩緩流出，使樹脂自然沉降而不留氣泡。

1.2.4 大孔樹脂的篩選 稱取不同型號真空抽干的樹脂各10.0g，分別置于150m L三角瓶中，各加入50m L一定濃度的提取液，25℃水浴振蕩吸附24h，測定此時(shí)溶液中多酚濃度。濾出提取液后，用蒸餾水洗去樹脂表面的多酚溶液，再各用50m L 70%乙醇溶液于相同條件下解吸，測定解吸液中多酚濃度。分別按照下列公式計(jì)算吸附量、吸附率、解吸率和回收率，從中篩選出性能優(yōu)良的樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

式中，C0為原液中多酚濃度，C1為吸附液中多酚濃度，C2為解吸液中多酚濃度，V0為吸附原液體積，m為樹脂質(zhì)量。

1.2.5 AB-8樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取10.0g真空抽干的AB-8樹脂，放入150m L三角瓶中，加入50m L多酚提取液，25℃水浴振蕩吸附6h，分別于1、2、3、4、5、6h測定多酚濃度，計(jì)算吸附率，并繪制吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.6 AB-8樹脂純化紅松松球鱗片多酚的研究 將預(yù)處理后的AB-8樹脂裝入1.5cm×40.0cm的柱中，樹脂柱體積（BV）66m L，待柱平衡后，取一定量多酚提取液，在不同條件下通過樹脂柱，以確定最佳的上樣體積、上樣濃度、水洗體積、洗脫劑濃度和洗脫劑體積。

1.2.6.1 上樣體積的考察 分別量取8、12、16、20、24m L濃度為1mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用2BV的蒸餾水洗脫，再用2BV 70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，測定其多酚含量并計(jì)算回收率。

1.2.6.2 上樣濃度的考察 分別量取20m L濃度為0.5、1、1.5、2、2.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用2BV的蒸餾水洗脫，再用2BV 70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，測定其多酚含量并計(jì)算回收率。

1.2.6.3 水洗體積的考察 量取20m L濃度為1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用蒸餾水洗脫樹脂柱。最佳的水洗體積以流出的水溶液透明時(shí)最為適宜。

1.2.6.4 洗脫劑濃度的考察 各取20m L濃度為1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用3BV的蒸餾水洗脫，再分別用40%、50%、60%、70%、80%、90%乙醇洗脫2BV，收集洗脫液，測定其多酚含量并計(jì)算回收率。

1.2.6.5 洗脫劑體積的考察 量取20m L濃度為1.5mg/m L的多酚溶液上柱，吸附3h，然后用3BV的蒸餾水洗脫，再用90%乙醇進(jìn)行洗脫，每5m L收集一管，并測定各管洗脫液中的多酚含量，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，洗脫液中多酚濃度（mg/m L）為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，確定洗脫劑體積。

1.2.7 多酚純度的測定 精確稱取一定質(zhì)量的粗提物和純化物的凍干粉復(fù)溶，按照式（1）測定多酚濃度，多酚純度計(jì)算公式如下：

式中，V′為凍干樣品復(fù)溶后溶液的體積（m L）；A″為凍干樣品復(fù)溶后1m L溶液的吸光值；M為凍干樣品的質(zhì)量（mg）。

1.2.8 抗氧化活性研究

1.2.8.1 還原Fe3+能力的測定 采用鐵氰化鉀還原法[8]。取0.5m L樣液置于離心管中，依次加入pH 6.6的磷酸緩沖液1.25m L、1%的鐵氰化鉀溶液1.25m L，于50℃水浴20m in后，迅速冷卻，再加入10%三氯乙酸溶液1.25m L，3000r/m in離心10m in，取上清液1.25m L，依次加入蒸餾水1.25m L、0.1%三氯化鐵溶液1.25m L，混勻后靜置10m in，700nm下測定吸光值A(chǔ)1，以蒸餾水代替樣液，測得吸光值A(chǔ)2，還原Fe3+能力的測定公式為：

1.2.8.2 DPPH自由基清除能力測定 參照熊建華的方法并略加修改[9]。配制1.0×10-4mol/L DPPH乙醇溶液，4℃避光保存。取1m L DPPH溶液，加入3m L樣液，立即混勻，室溫避光30min，于517nm下測得吸光值A(chǔ)e，無水乙醇替代DPPH測得吸光值A(chǔ)f，無水乙醇替代樣液測得吸光值A(chǔ)c。清除率計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同大孔樹脂對多酚的靜態(tài)吸附、解吸效果

考慮不同極性和型號的大孔樹脂對紅松松球鱗片多酚的吸附解吸能力不同，本實(shí)驗(yàn)選用了9種大孔樹脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101和D3520，分別測定了它們對紅松松球鱗片多酚的靜態(tài)吸附量、靜態(tài)吸附率、靜態(tài)解吸率和回收率，結(jié)果見表1。

表1 孔樹脂對紅松松球多酚的靜態(tài)吸附與解吸附性能Table 1 Absorption and desorption capabilities of different macroretieular resins to polyphenols

靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解吸率可以直接反映出大孔樹脂對活性物質(zhì)的吸附能力和解吸能力，而回收率可以反映出樹脂綜合性能的大小。由表1可知，9種大孔樹脂對紅松松球鱗片多酚的吸附和解吸性能各不相同，這是由于每種大孔樹脂的極性、比表面積和平均孔徑不同，對多酚的吸附解吸強(qiáng)弱就不同。9種大孔樹脂對紅松松球鱗片多酚的靜態(tài)吸附量、吸附率大小順序?yàn)椋篠-8＞NKA-Ⅱ＞ADS-7＞AB-8＞D101＞NKA-9＞X-5（HPD600）＞D3520，解吸率大小順序?yàn)椋篈B-8＞D101＞HPD600＞NKA-9＞X-5＞D3520＞S-8＞NKA-Ⅱ＞ADS-7。由此可知，9種大孔樹脂中，S-8的吸附能力最強(qiáng)，NKA-Ⅱ次之，但二者的解吸能力很弱，這是由于二者對紅松松球鱗片多酚的吸附力大，不易于解吸；而AB-8的吸附能力雖然不及S-8、NKA-Ⅱ和ADS-7，但它的解吸能力最強(qiáng)，分別是S-8的2倍、NKA-Ⅱ的2.6倍和ADS-7的3.7倍。綜合考慮樹脂的吸附和解吸性能，以回收率的高低為判定指標(biāo)，選用AB-8樹脂進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 AB-8樹脂的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線

AB-8樹脂對紅松松球鱗片多酚的吸附率與吸附時(shí)間的相關(guān)性如圖1所示。由圖1可以看出，AB-8樹脂對紅松松球鱗片多酚的吸附率隨著時(shí)間的延長而逐漸增大，并且初始階段吸附速度較快，吸附3h基本達(dá)到吸附平衡，3h以后，隨著時(shí)間的延長，吸附率增幅不再明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明AB-8具有快速吸附紅松松球鱗片多酚的特點(diǎn)，經(jīng)過3h即可達(dá)到較好的吸附效果。因而后續(xù)實(shí)驗(yàn)的吸附時(shí)間采用3h。

圖1 AB-8樹脂靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 The static adsorption kinetic curve of AB-8 resin

2.3 AB-8樹脂純化紅松松球鱗片多酚的研究

2.3.1 上樣體積對多酚回收率的影響 上樣體積對多酚回收率的影響如圖2所示。由圖2可知，隨著多酚上樣體積的增加，多酚的回收率逐漸降低，尤其當(dāng)上樣體積達(dá)到24m L時(shí)，已發(fā)生漏樣現(xiàn)象，多酚的回收率明顯低于其他各實(shí)驗(yàn)組。雖然上樣體積小，多酚的回收率高，但其純化效率較低。所以綜合考慮多酚的回收率和純化效率，上樣體積選擇20m L，即0.3BV。

圖2 上樣體積對多酚回收率的影響Fig.2 Effectof loaded amounton recovery rate of polyphenol

2.3.2 上樣濃度對多酚回收率的影響 上樣濃度對多酚回收率影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，在上樣濃度較低時(shí)，隨著樣品濃度的增加，多酚的回收率逐漸增加，但當(dāng)樣品濃度超過1.5mg/m L后，多酚的回收率又開始逐漸下降。這是因?yàn)椋瑢τ谝欢w積的樣品溶液來說，濃度的增加意味著溶質(zhì)與樹脂的接觸機(jī)會(huì)的增大，因此會(huì)增強(qiáng)樹脂對溶質(zhì)的吸附作用，吸附洗脫的效果也會(huì)更好。但樣品濃度過高，與之競爭吸附的雜質(zhì)也相應(yīng)增多，導(dǎo)致樹脂的吸附選擇性降低和多酚在樹脂內(nèi)部的擴(kuò)散能力降低。所以說適宜的樣品濃度能夠增加樹脂的分離效能。綜合考慮，多酚上樣液濃度選擇1.5mg/m L。

圖3 多酚濃度對多酚回收率的影響Fig.3 Effectof polyphenol concentration on recovery rate of polyphenol

2.3.3 水洗體積的確定 用蒸餾水淋洗樹脂柱能起到很好的除雜作用。水洗時(shí)，初始的流出液較渾濁，顏色較深，但從2BV開始，流出液顏色逐漸變淺，當(dāng)淋洗完3BV蒸餾水后，流出液基本透明，說明大部分雜質(zhì)已經(jīng)被去除。所以，水洗體積選擇為3BV。

2.3.4 洗脫劑濃度對多酚回收率的影響 由圖4可以看出，乙醇濃度對紅松松球鱗片多酚的回收率有較大影響。隨著乙醇濃度的增大，多酚回收率明顯提高。90%乙醇作為洗脫劑的多酚回收率比80%乙醇高了7%，比40%乙醇高了1倍。這說明在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，90%乙醇對紅松松球鱗片多酚的解吸能力最強(qiáng)，因而回收率也最高。所以，選擇90%的乙醇作為紅松松球鱗片多酚的洗脫劑。

圖4 乙醇濃度對多酚回收率的影響Fig.4 Effectof ethanol concentration on recovery rate of polyphenol

2.3.5 洗脫曲線的繪制和洗脫劑體積的確定 在已確定的最佳吸附洗脫條件下，取紅松松球鱗片多酚溶液上柱、吸附、洗脫，從醇洗開始，每5m L收集一管，共收集26管，測定每管洗脫液中多酚含量，以收集管數(shù)為橫坐標(biāo)，洗脫液中多酚含量（mg/m L）為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，動(dòng)態(tài)洗脫效果如圖5所示。從洗脫曲線圖5可以看出，開始時(shí)，洗脫液中多酚含量隨著洗脫體積的增加而增大，當(dāng)洗脫至第11管時(shí)，洗脫液中多酚含量達(dá)到最大值，之后隨著洗脫體積的增加，多酚含量逐漸下降，當(dāng)洗脫至21管即洗脫體積為1.6BV左右時(shí)，洗脫液中多酚含量已不足0.01mg/m L，從節(jié)省洗脫劑用量和洗脫時(shí)間方面考慮，洗脫劑的用量選擇1.6BV比較適宜。

圖5 AB-8大孔樹脂洗脫紅松松球鱗片多酚曲線Fig.5 Polyphenol dynamic desorption curve of resin AB-8

2.4 AB-8樹脂對紅松松球鱗片多酚的純化效果

按照上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳上柱和洗脫條件，對紅松松球鱗片多酚進(jìn)行純化，并按照式（6）計(jì)算得到純化前后的多酚純度分別為12.51%和35.07%。結(jié)果表明，AB-8樹脂分離純化紅松松球鱗片多酚的效果良好。

2.5 紅松松球鱗片多酚純化前后的抗氧化活性對比

2.5.1 對Fe3+的還原能力 粗提多酚和純化多酚還原能力的對比如圖6所示。由圖6可知，在實(shí)驗(yàn)的樣液濃度范圍內(nèi)，粗提多酚和純化多酚的還原能力都隨樣液濃度的增加而明顯增大，并且純化多酚的還原力明顯強(qiáng)于粗提多酚。

圖6 紅松松球鱗片多酚的還原力Fig.6 Reducing power of crude and purified polyphenol from Korean pine cone lamella

2.5.2 對DPPH的清除能力 紅松松球鱗片多酚對DPPH自由基的清除效果如圖7所示。由圖7可知，粗提多酚和純化多酚對DPPH自由基都有良好的清除效果，并且純化多酚的清除效果優(yōu)于粗提多酚。當(dāng)樣液濃度為30μg/m L時(shí)，純化多酚的清除率達(dá)到84.85%，以后隨著濃度的增加清除率基本不變；而此時(shí)粗提多酚的清除率為58.59%。

圖7 紅松松球鱗片多酚的DPPH自由基清除能力Fig.7 Scavenging effectof crude and purified polyphenol from Korean pine cone lamella on DPPH free radicals

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用靜態(tài)吸附法，考察了9種不同極性的大孔樹脂ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520對紅松松球鱗片多酚的吸附與解吸能力，以多酚回收率的高低為判定指標(biāo)，確定了AB-8為最佳吸附樹脂。通過AB-8樹脂對紅松松球鱗片多酚的純化工藝研究，初步得出了AB-8樹脂純化紅松松球鱗片多酚的最佳條件：上樣體積為0.3BV，上樣濃度為1.5mg/m L，上樣后靜態(tài)吸附3h，水洗3BV，洗脫劑為90%乙醇，洗脫劑用量為1.6BV。純化后，紅松松球鱗片多酚的純度由12.51%提高到35.07%。

3.2 紅松松球鱗片多酚具有很好的還原Fe3+的能力和清除DPPH自由基的能力，通過對比純化前后的紅松松球鱗片多酚的作用效果，可知純化多酚的作用效果明顯優(yōu)于粗提多酚，這說明紅松松球鱗片中的多酚成分對還原Fe3+和清除DPPH起了重要作用，但具體的作用機(jī)制和起作用的主要成分有待于進(jìn)一步研究。

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Purification technology of polyphenol from Korean pine cone lamella
w ith macroporous resins and research of their antioxidant ability

LIBo1，2，BAO Yi-hong1，GAO Feng3，WANG Zhen-yu1，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；
2.Departmentof Scientific Research Management，Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China；
3.Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

Accord ing to adsorp tion and desorp tion p roperty of macroporous resins to polyphenol，an op timal macroporous resin was chosen from ADS-7、S-8、NKA-9、NKA-Ⅱ、HPD600、AB-8、X-5、D101、D3520 resins for purifying polyphenol from Korean p ine cone lamella.AB-8 was found to be the most app rop riate resin.The purification of polyphenolwas stud ied，op timum cond itions were as follows：the loaded amount was 0.3BV，the concentration of polyphenolwas 1.5mg/m L，the time static absorp tion was 3h，the volume of elution water was 3BV，the eluting solventwas 90%alcohol，the volume of alcoholwas 1.6BV.Under these conditions，the purity of polyphenol was 12.51%in the purified sam p les，while it was 35.07%in the c rude sam p les.In add ition，the comparative study on the antioxidant ability was performed between c rude and purified samp les.The result showed that Fe3+reducing power and the scavenging ac tivity on DPPH radical were enhanced after the samp les were purified.

macroporous resins；purification；Korean pine cone lamella；polyphenol；antioxidantability

TS201.1

B

1002-0306（2012）22-0251-05

2012－08－14 *通訊聯(lián)系人

李波（1980-），男，在讀博士，助研，研究方向：植物活性成分的分離與開發(fā)。

國家自然科學(xué)基金（31170510）。