豬睪丸蛋白酶解抗氧化肽工藝優(yōu)化及抗氧化研究

周存山，余筱潔，馬海樂，*，戴夢(mèng)瑤，馬 寅，邱桂華，張建振

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；

2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300）

豬睪丸蛋白酶解抗氧化肽工藝優(yōu)化及抗氧化研究

周存山1，2，余筱潔1，馬海樂1，*，戴夢(mèng)瑤2，馬 寅2，邱桂華2，張建振2

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；

2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江臨安 311300）

采用中性蛋白酶酶解豬睪丸蛋白制備抗氧化肽。以還原力為指標(biāo)，通過正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定了酶解豬睪丸蛋白制備抗氧化肽的工藝條件：底物質(zhì)量濃度8%，起始pH7.0，酶用量360U/g（新鮮豬睪丸），溫度37℃，時(shí)間90min，相應(yīng)指標(biāo)還原力0.997。通過體外抗氧化活性的研究，發(fā)現(xiàn)豬睪丸抗氧化肽對(duì)·OH、H2O2、DPPH·和卵黃脂蛋白的IC50分別為0.47、0.56、0.86、0.42g/L。

豬睪丸，酶解，肽，自由基，抗氧化

食品的氧化變質(zhì)以及人體本身代謝過程中產(chǎn)生的自由基均會(huì)對(duì)細(xì)胞和組織造成嚴(yán)重的氧化損傷，從而導(dǎo)致動(dòng)脈硬化、心血管疾病、癌癥和身體衰老等疾病。將抗氧化劑作為食品添加劑添加到日常膳食中，可以清除自由基對(duì)人體的危害。由化學(xué)工藝制得的抗氧化劑如BTA（叔丁基羥基茴香醚）、BHT（二叔丁基羥基甲苯），雖然抗氧化效果良好，但對(duì)人體肝、脾、肺有害，具有蓄積性致癌作用[1]。因此，人們逐漸把目光轉(zhuǎn)向低價(jià)、低毒、高效的天然食品抗氧化劑。豬睪丸不僅價(jià)格便宜，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量非常高，是生產(chǎn)天然活性物質(zhì)理想的原料。通過實(shí)驗(yàn)可以更好地充分利用豬睪丸，研究其抗氧化性，探索制備高效抗氧化肽的途徑，從而拓展以豬睪丸為食品添加劑類食品的應(yīng)用范圍與目的，拓寬動(dòng)物蛋白功能性食品的開發(fā)利用。有效地利用了我國(guó)豐富的豬肉加工產(chǎn)業(yè)的副產(chǎn)品資源，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。總之，利用現(xiàn)代高新技術(shù)開發(fā)高附加值產(chǎn)品，進(jìn)一步提高動(dòng)物副產(chǎn)品的利用率，對(duì)動(dòng)物副產(chǎn)品的工業(yè)化和生態(tài)環(huán)境保護(hù)都具有重要意義。酶解物抗氧化活性的強(qiáng)弱根據(jù)還原力的大小來判斷，以還原能力的大小為評(píng)價(jià)指標(biāo)，進(jìn)行工藝優(yōu)化研究，確定具有成本低、重復(fù)性好、安全可靠、易操作、高得率等優(yōu)點(diǎn)的最佳酶解條件。影響蛋白質(zhì)酶解的因素主要有時(shí)間、pH、溫度、酶用量與底物濃度等[2]。研究以還原力為指標(biāo)，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)對(duì)中性蛋白酶（中性蛋白酶在pH調(diào)節(jié)上比較溫和，不需要添加大量的堿液[3-4]）水解豬睪丸的組合條件進(jìn)行優(yōu)化；進(jìn)一步進(jìn)行體外抗氧化研究，包括清除羥自由基（·OH）的能力、H2O2的清除作用、清除DPPH·的能力和抗脂質(zhì)過氧化作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

中性蛋白酶 酶活6000U/g，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫代巴比妥酸等均為分析純?cè)噭?采購(gòu)于杭州禾德化工有限公司；將新鮮的豬睪丸洗凈后，修整再切塊，絞碎成肉糜，稱取適量豬睪丸，加入一定蒸餾水打漿，配制一定濃度的溶液。

PHS-2C精密酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；方型恒溫?cái)?shù)顯水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；JJ-1精密增力電動(dòng)攪拌器 常州賽普實(shí)驗(yàn)儀器廠；TDL-5-A低速臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝流程 豬睪丸溶液→50℃預(yù)熱10min→中性蛋白酶酶解90min→沸水保溫20min滅酶→4000r/min離心15min→上清液→指標(biāo)測(cè)定

1.2.2 酶解工藝優(yōu)化 根據(jù)動(dòng)物蛋白酶解文獻(xiàn)[3-4]，選擇溫度（A，℃）、底物濃度（B，%）、酶用量（C，U/g新鮮豬睪丸）、反應(yīng)起始pH（D）作為實(shí)驗(yàn)因素，以還原力為指標(biāo)對(duì)豬睪丸的中性蛋白酶水解參數(shù)作正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，因素水平設(shè)計(jì)見表1。按正交實(shí)驗(yàn)所獲得的最佳酶解條件，對(duì)豬睪丸進(jìn)行酶解，酶解液經(jīng)離心后取上清液冷凍干燥，測(cè)酶解物抗氧化能力。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.2.3 酶解產(chǎn)物抗氧化活性測(cè)定

1.2.3.1 還原力的測(cè)定 參考Mezrameto等[5]的方法并略作改動(dòng)。取樣品lm L，加入磷酸鹽緩沖溶液（0.2mol/L，pH 6.6）2.5m L和1%鐵氰化鉀2.5m L，50℃保溫20m in，加入10%的三氯乙酸5m L，充分混合，移取上清液2.5m L，加入2.5m L蒸餾水和0.5m L 0.1%的三氯化鐵溶液，靜置10m in，以蒸餾水調(diào)零，于700nm處測(cè)定吸光值，吸光值增加表明還原力增強(qiáng)。

1.2.3.2 清除羥自由基（·OH） 采用鄰二氮菲Fe2+氧化法[6]具體方法：取2m L樣品，加入0.2m L 6mmol·L-1FeSO4、6mmol·L-1H2O2，混合后靜置10m in，再加入2m L 6mmol·L-1水楊酸，混勻，靜置30m in，在510nm處測(cè)其吸光值記為A·OH-1，當(dāng)蒸餾水代替水楊酸時(shí)的吸光值記為A·OH-2，空白對(duì)照組以蒸餾水代替樣品，吸光值記為A·OH3。按照下式計(jì)算對(duì)·OH的清除率Y·OH（%）=[1-（A·OH-1-A·OH-2）/A·OH-3]×100

1.2.3.3 清除H2O2的測(cè)定 將不同濃度樣品溶于3.4m L 0.1mol·L-1的磷酸緩沖液（pH 7.4）中，加入0.6m L 4mol·L-1H2O2溶液，放置10min后，混合液在230nm下測(cè)定吸光值，以不加樣品上的H2O2溶液作對(duì)照[7]。對(duì)H2O2的抑制率：YH2O2（%）=[（AH2O2-1-AH2O2-2）/AH2O2-1]×100，式中，AH2O2-1―不加樣品的吸光度；AH2O2-2―加入樣品的吸光度。

1.2.3.4 清除DPPH·的測(cè)定 在2m L新配制的DPPH·溶液（20mmol·L-1）中加入2m L不同濃度樣品，室溫暗光下反應(yīng)30min，在517nm處測(cè)吸光值。清除DPPH·：YDPPH（%）=[ADPPH-3-（ADPPH-1-ADPPH-2）/ADPPH-3]×100，式中，ADPPH-1―加入樣品和DPPH·時(shí)的吸光度；ADPPH-2―加入樣品，但不加入DPPH·時(shí)的吸光度；ADPPH-3―不加樣品，加入DPPH·時(shí)的吸光度。

1.2.3.5 抗脂質(zhì)過氧化作用 以卵黃脂蛋白為底物的LPO模型反應(yīng)體系包括：體積比為1∶25稀釋的卵黃懸液（卵黃用等體積的pH 7.45，0.lmol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）配成，使用前磁力攪拌10m in，一定濃度的樣品溶液0.lm L、25mmol/L FeSO4·7H2O溶液0.2m L，用PBS補(bǔ)足至2.0m L[8]。對(duì)照不加樣液外其他試劑同前，并提前加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%TCA溶液0.5m L。將上述2種試管同時(shí)置于37℃恒溫水浴鍋中保溫培養(yǎng)1h。取出后，加入20%TCA 0.5m L，靜置10m in后，與對(duì)照管于3500r/min離心10min，取2.0m L上清液，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8%硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0m L，加塞于100℃水浴15min，取出冷卻。空白管以2.0m L PBS溶液代替，在532nm下測(cè)定吸光度，樣品對(duì)卵黃脂蛋白LPO的抑制率表示：YLPO（%）=（ALPO-1-ALPO-2）/ALPO-1× 100，式中，ALPO-1―不加樣品的吸光度；ALPO-2―加入樣品的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶解工藝優(yōu)化

豬睪丸抗氧化肽酶解工藝正交優(yōu)化見表2，根據(jù)表2中各因素的極差大小可看出，各因素對(duì)還原力影響的主次順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B，即起始pH＞酶用量＞溫度＞底物濃度。基于還原力獲得最優(yōu)組合A1B2C2D2，即水解溫度為37℃、底物濃度為8%、酶用量為360U/（g新鮮豬睪丸）、起始pH為7.0、時(shí)間90m in。在此條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，豬睪丸酶解物的還原力為0.997，說明得到的最優(yōu)組合是合理的。

表2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 The experimental design and results

2.2 最優(yōu)條件下產(chǎn)物抗氧化結(jié)果分析

2.2.1 酶解產(chǎn)物的羥自由基（·OH）清除率 酶解產(chǎn)物對(duì)·OH的清除率如圖1所示。

由圖1可知，豬睪丸酶解物中抗氧化肽對(duì)羥自由基的清除率隨濃度的增加而增強(qiáng)，其清除效果呈線性的量效關(guān)系。當(dāng)濃度為1g/L時(shí)，清除率達(dá)81.5%。水解物對(duì)·OH有較強(qiáng)的清除能力，可能跟·OH極強(qiáng)的氧化能力及肽類能與Fe2+鰲合在一起有關(guān)。由于·OH極強(qiáng)的氧化能力能將所有的有機(jī)質(zhì)都氧化反應(yīng)，從而使肽類易于被氧化，并且肽類也有可能與Fe2+鰲合在一起從而減緩了Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH。通過對(duì)濃度與清除率間的回歸分析，可以得到豬睪丸抗氧化肽的半抑制濃度IC50為0.47g/L。

圖1 豬睪丸酶解物對(duì)·OH的清除率Fig.1 Radical（·OH）scavenging of peptides from swine testis

2.2.2 酶解產(chǎn)物的H2O2清除率 酶解產(chǎn)物對(duì)H2O2的清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 豬睪丸酶解物對(duì)H2O2的清除率Fig.2 H2O2 scavenging of peptides from swine testis

由圖2可知，隨著樣品濃度的增大，豬睪丸酶解物中的抗氧化肽對(duì)H2O2的清除效果也隨著濃度的增大迅速增強(qiáng)，呈量效關(guān)系。當(dāng)濃度為1g/L時(shí)，清除率高達(dá)78.57%。通過對(duì)濃度與清除率間的回歸分析，可以得到豬睪丸抗氧化肽的半抑制濃度IC50為0.56g/L。

2.2.3 酶解產(chǎn)物的DPPH·清除率 酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH·的清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 豬睪丸酶解物對(duì)DPPH·的清除率Fig.3 DPPH·scavenging of peptides from swine testis

由圖3可知，豬睪丸酶解物中抗氧化肽對(duì)DPPH·的清除率跟其濃度具有量效關(guān)系，其清除率隨著濃度的增大而增大。當(dāng)濃度為1g/L時(shí)，清除率為55.4%。通過對(duì)濃度與清除率間的回歸分析，可以得到豬睪丸抗氧化肽的半抑制濃度IC50為0.86g/L。

2.2.4 酶解產(chǎn)物的抗脂質(zhì)過氧化活性 酶解產(chǎn)物的脂質(zhì)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 豬睪丸酶解物的脂質(zhì)抗氧化作用Fig.3 Radical（Lipids）scavenging of peptides from swine testis

由圖4可知，豬睪丸酶解物對(duì)Fe2+誘發(fā)的卵黃脂蛋白過氧化的抑制是逐步線性增加的過程。當(dāng)濃度為1.0g/L時(shí)，抑制作用最大，抑制率高達(dá)85.3%。通過對(duì)濃度與清除率間的回歸分析，可以得到豬睪丸抗氧化肽的半抑制濃度IC50為0.42g/L。

3 結(jié)論

以豬睪丸蛋白為原料，用酶解法獲得抗氧化肽，還原力為過程指標(biāo)，研究了豬睪丸抗氧化肽的酶解工藝優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上，對(duì)制備的豬睪丸酶解物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究。

3.1 獲得中性蛋白酶水解豬睪丸的最優(yōu)工藝條件為：酶的添加量為360U/（g新鮮豬睪丸），酶解溫度37℃，起始pH7.0，底物濃度8%，時(shí)間90min。在該酶解條件下豬睪丸酶解物的還原力達(dá)到0.997。

3.2 根據(jù)確定的最佳酶解工藝來制備豬睪丸酶解物，考察了其對(duì)羥自由基（·OH）、H2O2和DPPH·的清除效果，以及對(duì)卵黃脂蛋白氧化的抑制作用四個(gè)方面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：該酶解物對(duì)·OH和H2O2具有較好的清除作用，對(duì)DPPH·也具有一定的清除效果，酶解物對(duì)Fe2+誘發(fā)的卵黃脂蛋白的過氧化抑制作用最強(qiáng)。

[1]裴小平，唐道邦，肖更生，等.抗氧化肽制備的應(yīng)用現(xiàn)狀及趨勢(shì)[J].食品工業(yè)科技，2009（2）：319-322.

[2]郭瑤.羅非魚皮膠原肽的制備及其抗氧化活性的研究[D].青島：中國(guó)海洋大學(xué)，2006.

[3]曲文娟，馬海樂，賈俊強(qiáng)，等.米糟蛋白酶解制備生物肽及其抗氧化活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012（8）：183-186.

[4]馬海樂，王中斌，駱琳，等.不補(bǔ)料連續(xù)酶解-膜分離耦合制備魚鱗膠原蛋白抗氧化肽的研究[J].食品工業(yè)科技，2010（8）：204-207.

[5]周向軍，高義霞，張永德，等.莧菜多酚提取工藝及抗氧化研究[J].食品工業(yè)科技，2012（6）：327-331.

[6]賈俊強(qiáng)，馬海樂，曲文娟，等.超聲預(yù)處理大米蛋白制備抗氧化肽[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2008（8）：288-293.

[7]肖華山，何文錫，傅文慶，等.一種用分光光度法檢測(cè)氧自由基的新方法[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1999（2）：180-183.

[8]Zhou C，Yu X，Zhang Y，et al.Ultrasonic degradation，purification and analysis of structure and antioxidant activity of polysaccharide from Porphyra yezoensis Udea[J].Carbohydrate Polymers，2012（3）：2046-2051.

Enzymatic optim ization and antioxidant activities of peptides from sw ine testis

ZHOU Cun-shan1，2，YU Xiao-jie1，MA Hai-le1，*，DAIM eng-yao2，MA Yin2，QIU Gui-hua2，ZHANG Jian-zhen2
（1.School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China；
2.School of Agriculture and Food Science，Zhejiang A&FUniversity，Lin’an 311300，China）

This artic le focused on neutral p rotease hyd rolysis of sw ine testis p rotein for ob tain antioxidant pep tides.The conditions of enzymatic hyd rolysis of sw ine testis p rotein for antioxidant pep tides were designed and obtained w ith orthogonal by using the reducing power index：substrate concentration 8%，pH7.0，enzyme dosage 360U/g（fresh sw ine testis），tem perature at37℃and time 90m in.The reducing power of the hyd rolysis of sw ine testis under the condition was 0.997.The IC50of·OH、H2O2、DPPH rad ical-scavenging and yolk lipop rotein were 0.47、0.56、0.86、0.42g/L，respectively.

sw ine testis；enzymatic hyd rolysis；pep tide；radicals；antioxidant

TS251.1

B

1002-0306（2012）22-0284-04

2012－06－12 *通訊聯(lián)系人

周存山（1979-），副教授，主要從事天然產(chǎn)物資源化及功能化研究。

浙江省自然科學(xué)基金（Y3110025）；重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（2010F30003，JAPP2010-4）。