枳實軟化和切制的工藝研究

尹麗波，趙啟苗，林桂梅，侯 影，賈天柱

（1.遼寧中醫藥大學 藥學院國家中醫藥管理局中藥炮制重點研究室／遼寧省中藥炮制工程技術研究中心，遼寧 大連 116600；2.遼寧中醫藥大學 杏林學院，遼寧 沈陽 110167）

枳實為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.及其栽培變種或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，味苦、辛、酸，性微寒，歸脾胃經，具有破氣消積、化痰散痞的功能，常用于積滯內停、痞滿脹痛等癥［1］。枳實主要有效成分有生物堿，如辛弗林、N-甲基酪胺等；黃酮類成分，如橙皮苷、柚皮苷和新橙皮苷等［2］。枳實歷代有多種炮制方法，但均需先切制成枳實片，再根據需要按不同方法炮制。此外，清代吳儀洛在《本草從新》中也曾提出“藥肆中俱切為飲片”，中藥必須切成飲片才能用于臨床［3］。目前，切制枳實飲片工藝控制主要憑經驗，缺乏具體的工藝參數。本試驗以辛弗林含量和柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量及出膏率為指標對切制枳實工藝進行優選，為規范切制枳實的炮制工藝提供技術參數，為切制枳實飲片的質量控制提供一定的科學依據。

1 儀器與試藥

FA1004B電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；METTLER AE240型十萬分之一分析天平（瑞士METTLER）；KQ-250DB型數控超聲波清洗器（超聲電功率250W，頻率40kHz）；DG101-2A烘箱；日本島津LC-20AT液相色譜儀（SPD-M20A檢測器，LC-20AB泵，CTO-20A柱溫箱，SIL-20A自動進樣器，CBM-20A數據轉換模器）；島津LC-Solution色譜數據工作站。

枳實生品購自江西新干縣，經鑒定為蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumL.的干燥幼果；辛弗林對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110727-200306）；柚皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110722-200309），橙皮苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號11072-200613）；新橙皮苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%），娃哈哈純凈水；甲醇、乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 辛弗林含量的測定

2.1.1 測定條件

色譜柱為Diamonsil C18（5μm，200mm×4.6mm）；流動相：甲醇-磷酸水溶液（0.18%磷酸，0.22%十二烷基硫酸鈉）58∶42；流速：1mL·min-1；柱溫：40℃；檢測波長：275nm；進樣量：10μL。色譜見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備

精密稱取辛弗林對照品，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得0.1852mg·mL-1的辛弗林對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

取切制枳實樣品適量，粉碎，取中粉1g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入甲醇100mL，稱定重量，超聲提取30min后放冷，再稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液50mL至蒸發皿中，蒸干，稱干膏重。干膏加甲醇溶解，移至10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，備用。

圖1 辛弗林對照品及供試品色譜

2.1.4 方法學考察

（1）線性范圍考察。精密吸取辛弗林對照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項下操作，并測定峰面積積分值，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得辛弗林線性回歸方程為Y＝6E+06X-711551，相關系數r＝0.9996。線性范圍為0.1852～3.704μg／mL。

（2）精密度試驗。精密吸取供試品溶液10μL，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，測定峰面積積分值，結果RSD為1.8%，表明儀器精密度良好。

（3）穩定性試驗。精密吸取供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、8、24h進樣分析，按“2.1.1”項下操作，測定供試品中辛弗林含量，結果RSD為1.8%，表明供試品溶液在24h內穩定。

（4）重復性試驗。取同一樣品6份，按“2.1.3”項下制備供試品溶液，“2.1.1”項下色譜條件操作，分別進樣10μL，測定各樣品中辛弗林的平均含量為0.3312%，RSD為1.7%。

（5）加樣回收率試驗。精密稱定6份已知含量枳實樣品0.5g，分別加入0.8924mg·mL-1的辛弗林對照品溶液2mL，按照“2.1.3”項下操作，配制成供試品溶液，按“2.1.3”項下色譜條件進樣操作，計算加樣回收率，結果辛弗林的加樣回收率為98.75%，RSD為1.6%。結果見表1。

表1 辛弗林加樣回收率

2.2 柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量測定

2.2.1 測定條件

色譜柱：Diamonsil C18（5μm，200mm×4.6mm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（20.5∶79.5）；流速：0.6mL·min-1；柱溫：35℃；進樣量：10μL；檢測波長：283nm。色譜見圖2。

2.2.2 對照品溶液的制備

精密稱取柚皮苷對照品1.570mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.03140mg·mL-1的柚皮苷對照品溶液；精密稱取橙皮苷對照品2.835mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.0567mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液；精密稱取新橙皮苷對照品2.355mg，置50mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，得0.0471 mg·mL-1的新橙皮苷對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

按“2.1.3”項下方法操作制得的溶液，精密吸取2mL于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，用0.45μm的微孔濾膜濾膜濾過，備用。

圖2 黃酮類對照品及供試品色譜

2.2.4 方法學考察

（1）線性范圍。精密吸取柚皮苷對照品溶液1、5、10、20、50、100μL，按“2.1.1”項下操作，測定峰面積積分值，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得出柚皮苷線性回歸方程為Y＝1E+07X-288165，相關系數r＝0.9999。表明柚皮苷的進樣量在0.0314～3.14μg／mL范圍內線性關系良好。精密吸取橙皮苷對照品溶液1、2、5、10、15、20μL，按“2.1.1”項下色譜條件操作，測定峰面積積分值，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，得出橙皮苷線性回歸方程為Y＝4E+06X+17543，相關系數r＝0.9998。表明橙皮苷的進樣量在0.0567～1.134 μg／mL范圍內線性關系良好。精密吸取新橙皮苷對照品溶液1、5、10、20、50、100μL，按“2.1.1”項下色譜條件操作，測定峰面積積分值，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，進行線性回歸，得新橙皮柑線性回歸方程為Y＝8E+06X+129867，相關系數r＝0.9999。表明新橙皮苷的進樣量在0.0471～4.710μg／mL范圍內范圍內線性關系良好。

（2）精密度試驗。精密吸取“2.2.2”項下供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件操作，連續進樣6次，結果測定供試品溶液中柚皮苷峰面積RSD為2.1%，橙皮苷峰面積RSD為1.5%，新橙皮柑峰面積RSD為2.4%，表明精密度良好。

（3）穩定性試驗。精密吸取“2.2.3”項下供試品溶液10μL，分別于0、1、2、4、8、24h進樣分析，按“2.1.1”項下色譜條件操作，結果測定柚皮苷峰面積RSD為1.4%，橙皮苷峰面積的RSD為1.9%，新橙皮苷的峰面積RSD為1.1%，表明供試品溶液在24h內穩定。

（4）重復性試驗。取同批樣品6份，按“2.2.3”項下制作供試品溶液，“2.2.1”項下色譜條件操作，進樣10μL，測定各樣品中柚皮苷的RSD為2.4%；橙皮苷的RSD為1.8%，RSD為1.7%。

（5）加樣回收率試驗。精密稱定6份已知含量的枳實樣品0.04g，分別加入1.8998mg·mL-1的柚皮苷對照品溶液2mL，按照“2.2.3”項下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，柚皮苷的加樣回收率為99.11%，RSD為1.2%。結果見表2。

精密稱定6份已知含量的枳實樣品0.35g，分別加入1.5047mg·mL-1的橙皮苷對照品溶液2mL，按照“2.2.3”項下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率，橙皮苷的加樣回收率為98.05%，RSD為2.1%，結果見表3。

精密稱定6份已知含量的枳實樣品0.02g，分別加入1.2672mg·mL-1的新橙皮苷對照品溶液2mL，按照“2.2.3”項下操作配制成6份加樣供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進樣分析，計算加樣回收率，結果新橙皮苷的加樣回收率為99.52%，RSD為1.3%，結果見表4。

3 枳實軟化方法的正交試驗

3.1 實驗設計

根據預實驗，選取浸泡法為枳實的軟化方法。在軟化過程中，考慮到軟化時間（A）、軟化溫度（B）、軟化加水量（C）三個因素為主要影響因素，故將這三個因素作為正交試驗的考察因素，選用L9（3）4正交表安排實驗，每個因素設計3個水平，因素水平安排見表5，按“2.1”和“2.2”項下色譜條件和制備方法分別測定枳實中辛弗林含量和黃酮（柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷）含量以及出膏率，用加權平均法計算綜合評分，其中辛弗林的含量，黃酮總含量以及出膏率的權重分別為0.4，0.4和0.2。

表2 柚皮苷加樣回收率

表3 橙皮苷加樣回收率

表4 新橙皮苷加樣回收率

表5 因素水平

3.2 試驗方法

按正交試驗表進行試驗，取枳實藥材100g，加入一定量水，在不同軟化溫度下軟化。取樣測定，根據測定結果計算綜合評分。測定數據和計算結果分別見表6、表8，方差分析結果見表9。

表6 L9（3）4 正交試驗結果

表7 正交試驗結果分解

表8 枳實軟化正交試驗因素水平分析

表9 方差分析

3.3 試驗結果及分析

表7和表8結果顯示：因素A對綜合評分的結果有顯著影響，因素B、C對結果無顯著影響。極差分析認為各因素的主次順序是A＞B＞C。最佳工藝條件為A3B3C2，即每100g藥材使用100mL水，在溫度為10℃下，軟化12h。

4 枳實的切制研究

枳實的切制研究，先將枳實按以下方法進行切制：①橫切，使藥材的厚度為0.5mm；②橫切，使藥材的厚度為1～2mm；③橫切，使藥材的厚度為2～4mm；④縱切，使藥材的厚度為0.5mm；⑤縱切，使藥材的厚度為1～2mm；⑥縱切，使藥材的厚度為2～4mm。分別取上述枳實切片按“2.1.2”和“2.2.2”項下方法制備成樣品，分別測得上述6種樣品中的指標，進行綜合評分，分別為85.44，95.21，90.12，88.32，96.89，90.78。其中切制厚度為1～2mm枳實樣品綜合評分要明顯高于切制成其他厚度的。切制方法的考察，橫切與縱切對枳實樣品的綜合評分影響不大，且枳實藥材切制過程中橫切較縱切容易，故選用橫切作為枳實的切制方法。

5 驗證實驗

為驗證上述最佳工藝的科學性、穩定性和可重復性，進行了3次驗證實驗，結果表明正交實驗結果準確、可靠。結果見表9。

表9 驗證試驗

6 討論與結論

本實驗在正交試驗之前做過軟化方法篩選的預實驗，分別選取浸泡法、淋法和蒸法對枳實進行軟化。結果表明，蒸法軟化枳實藥材時其指標性成分含量下降幅度較大，可能由于其高溫的緣故，使枳實中的有效成分破壞。淋法與浸泡法軟化的枳實藥材則無明顯差別，且浸泡法比淋法操作簡單，容易掌握，結合實驗結果并考慮到生產實際確定選擇浸泡法為枳實藥材的軟化方法。枳實藥材質地堅硬，需長時間浸潤才能潤透，但時間不宜過長，加水量不宜過多，以免傷水，軟化藥材時要以“藥透水盡”為標準。枳實中有效成分辛弗林及黃酮類化合物若長時間高溫加熱，可導致其結構破壞，有效成分降低，故本實驗枳實的軟化溫度因素考查范圍規定為10～30℃［4，5］。

本實驗還對枳實切片以后的烘干溫度進行了初步試驗，發現樣品在恒溫60℃的烘箱中烘干其有效成分損失不大，但烘干溫度超過60℃，其有效成分損失很大，其主要原因可能是有效成分發生變化，故枳實切制后烘干溫度不宜超過60℃。本試驗認為枳實的軟化方法為浸泡法，具體為每100g藥材使用100mL水，在10℃下，軟化12h。切制方法為橫切，切制厚度為1～2mm，使得枳實的有效成分損失最小，綜合評分最高。此種軟化和切制工藝合理可行。本實驗選擇多指標進行綜合評價枳實的軟化和切制工藝條件，為中藥切制工藝優選提供了較為科學、全面的思路，也符合中醫藥治療疾病多成分綜合作用的特點。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：230.

［2］王文凱，劉紅娜，雷丹.不同炮制方法對枳實中柚皮苷和新橙皮苷含量的影響［J］.江西中醫學院學報，2007，19（6）：50.

［3］賈天柱.中藥炮制學［M］.上海：上?？茖W技術出版社，2008：66-67.

［4］王佳，周家雨，郭軍偉，等.枳實中辛弗林和橙皮苷的聯合提取工藝研究［J］.天然產物研究與開發，2009，21（6）：1058-1060.

［5］李榮，李俊.黃酮類化合物藥理活性及其構效關系研究進展［J］.安徽醫藥，2005，9（7）：481-483.