乳品中β-內酰胺類抗生素快速檢測試紙條研制

羅曉琴，劉 琳，劉文芳，崔彥虎，余厚美

（北京望爾生物技術有限公司，北京102206）

乳品中β-內酰胺類抗生素快速檢測試紙條研制

羅曉琴，劉 琳，劉文芳，崔彥虎，余厚美

（北京望爾生物技術有限公司，北京102206）

通過β-內酰胺類抗生素-載體蛋白偶聯物的合成，單克隆抗體的制備與純化，膠體金標記物的制備，β-內酰胺類抗生素單克隆抗體-膠體金標記物的制備并凍干到微孔試劑，樣品吸收墊和反應膜的制備等研究過程，研制出乳制品中β-內酰胺類抗生素的快速檢測試紙條。檢測限分別為：青霉素G 2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/鄰青霉素/雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L；本試紙條特異性好、假陽性率不高于3%、假陰性率為0，檢測時間不超過15min，檢測限量達到了我國和歐盟的要求，適用于乳品流通環節乳品中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測。

β-內酰胺類抗生素，乳品，膠體金，試紙條

β-內酰胺類抗生素是指化學結構中含有β-內酰胺環的一類抗生素，主要包括青霉素類和頭孢菌素類，其作用特點是能夠抑制細菌黏肽轉肽酶的活性，從而阻止細菌細胞壁的合成，呈現殺菌活性[1]。β-內酰胺類抗生素廣泛用于控制奶牛的乳房炎，治療動物尿道、胃腸道和呼吸道感染等。但由于其使用方法不當或不遵守休藥期規定等原因，極易殘留在使用組織中，造成嚴重危害：使人體產生耐藥菌株，給使用抗生素治療疾病帶來不良影響；出現過敏反應；破壞人體內正常菌群的平衡狀態，甚至造成“二重感染”[2]。目前，牛奶及生鮮奶中β-內酰胺類抗生素殘留的檢測方法依據不同的檢測原理，大體可分為三大類：微生物受阻檢測、理化檢測法、免疫學分析法。微生物受阻檢測方法主要有抑菌圈實驗、渾濁度實驗、變色型檢測金標試劑盒方法，其檢測成本價低，但是靈敏度低、耗時長、耐藥菌的存在容易導致誤檢；理化檢測方法有液相色譜法、色譜/質譜聯用技術、氣相色譜法等，該檢測方法精確度高，但其存在檢測成本高，檢測設備復雜，對檢測人員的要求較高，檢測耗時長等缺點。免疫分析法由于具有快速、靈敏、特異等特點常用于檢測β-內酰胺類抗生素，目前主要為酶聯免疫檢測法和放射免疫分析法[3]。我國原料乳中β-內酰胺類抗生素殘留嚴重，對其開展監控檢測是我國乳業發展中極為關注的問題，研制β-內酰胺類抗生素殘留快速檢測的方法勢在必行，本研究采用膠體金免疫法開發了一種快速準確檢測牛奶中β-內酰胺類抗生素的試紙條。我國235號文件規定的牛奶中β-內酰胺類抗生素藥物限量要求如下：苯唑西林30μg/L、氯唑西林30μg/L、頭孢噻呋100μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢氨芐100μg/L、氨芐西林10μg/L、阿莫西林10μg/L。歐盟對牛奶中β-內酰胺類抗生素藥物限量要求如下：青霉素G 4μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林4μg/L、苯唑青霉素30μg/L、鄰青霉素30μg/L、雙青霉素30μg/L、萘夫西林30μg/L、頭孢喹諾20μg/L、頭孢乙腈125μg/L、頭孢洛寧20μg/L、頭孢唑林50μg/L、頭孢哌酮50μg/L、先鋒霉素Ⅷ60μg/L、頭孢噻呋100μg/L[4]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1%氯金酸 sigma公司；檸檬酸三鈉 廣州化學試劑廠；磷酸鹽緩沖液（簡稱PBS） 含酪蛋白、吐溫-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸鹽溶液，其中酪蛋白在復溶緩沖液中的終濃度為0.05%~0.1%（體積百分含量），吐溫-80在復溶緩沖液中的終濃度為0.05%~ 0.15%（質量百分含量）；雙蒸水，1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（簡稱EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（簡稱NHS），卵清蛋白，牛血清白蛋白。

微量移液器 單道20~200μL和100~1000μL、多道50~300μL，美國Thermo；離心機TDL-408等 上海安亭。

1.2 頭孢類藥物-載體蛋白偶聯物的合成與鑒定

頭孢類藥物是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發機體產生免疫應答，必須與大分子載體蛋白偶聯后才具有免疫原性。

1.2.1 免疫原的制備-頭孢類藥物與卵清蛋白偶聯物合成 取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1.5mL雙蒸水溶解，得到（Ⅰ）液；取1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（簡稱EDC）40mg和N-羥基琥珀酰亞胺（簡稱NHS）60mg用0.5mL水溶解得到（Ⅱ）液；在攪拌狀態下將（Ⅱ）加入（Ⅰ）中，反應1h，得到（Ⅲ）液；取卵清蛋白60mg用8mL水溶解，得到（Ⅳ）液；將（Ⅳ）加入（Ⅲ）中，室溫攪拌反應24h分別得到免疫原，用0.02mol/LPBS緩沖液透析3d，分裝、凍存。

1.2.2 包被原的制備-頭孢類藥物與牛血清白蛋白偶聯物合成 取頭孢匹林的鈉鹽40mg，用1.5mL雙蒸水溶解，得到（Ⅰ）液；取EDC 40mg和NHS 60mg用0.5mL水溶解得到（Ⅱ）液；在攪拌狀態下將（Ⅱ）加入（Ⅰ）中，反應1h，得到（Ⅲ）液；取牛血清白蛋白100mg用8mL水溶解，得到（Ⅳ）液；將（Ⅳ）加入（Ⅲ）中，室溫攪拌反應24h分別得到包被原，用0.02mol/L PBS透析3d，分裝、凍存。

1.2.3 頭孢類藥物-載體偶聯物的鑒定 將載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4 PBS調零，用紫外分光光度計在波長200~800nm范圍內掃描，得到載體蛋白、頭孢類藥物、頭孢類藥物-載體蛋白偶聯物的吸收曲線。三者出現不同的吸收曲線，表明頭孢類藥物與載體蛋白偶聯成功。

1.3 頭孢類藥物單克隆抗體的制備

頭孢類藥物單克隆抗體的制備主要包括動物免疫、細胞融合和克隆化、細胞凍存和復蘇以及單克隆抗體的制備和純化。

1.3.1 動物免疫 將1.2得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150μg/只，使其產生抗血清。

1.3.2 細胞融合和克隆化 取免疫Balb/c小鼠脾細胞，按9∶1（數量配比）比例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選得到穩定分泌頭孢類藥物單克隆抗體的頭孢類藥物單克隆雜交瘤細胞株。

1.3.3 細胞凍存和復蘇 將雜交瘤細胞用凍存液制成1×109個/mL的細胞懸液，在液氮中長期保存。復蘇時取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養瓶內培養。

1.3.4 單克隆抗體的制備與純化 增量培養法：將雜交瘤細胞置于細胞培養基中，在37℃條件下進行培養，用辛酸-飽和硫酸銨法將得到的培養液進行純化，得到單克隆抗體，-20℃保存。所述細胞培養基為向RPMI-1640培養基中添加小牛血清和碳酸氫鈉，使小牛血清在細胞培養基中的終濃度為20%（質量百分含量），使碳酸氫鈉在細胞培養基中的終濃度為0.2%（質量百分含量）；所述細胞培養基的pH為7.4。

1.4 羊抗鼠抗抗體的制備

以羊作為免疫動物，以鼠源抗體為免疫原對無病原體羊進行免疫，得到羊抗鼠抗抗體。

1.5 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的制備

先制備好膠體金標記物，再向膠體金標記物中加入1.3.4制備好的單克隆抗體，形成頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物。

1.5.1 膠體金的制備 用雙蒸去離子水將1%氯金酸稀釋成0.01%（質量百分含量），置磁力加熱攪拌器上攪拌煮沸，每100mL 0.01%氯金酸加入2.5mL 1%檸檬酸三鈉，繼續攪拌加熱反應至液體呈紅色時停止加熱，冷卻至室溫后補足失水。制備好的膠體金外觀純凈、透亮、無沉淀和漂浮物。

1.5.2 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的制備 在磁力攪拌下，用0.2mol/L碳酸鉀調節膠體金的pH至7.0，按50~100mg抗體/mL膠體金的標準向膠體金溶液中加入上述頭孢類藥物單克隆抗體，繼續攪拌混勻30min，加入10%BSA至BSA在膠體金溶液中的終濃度為1%（體積百分含量），靜置30min。12000r/min、4℃離心30min，棄上清液，沉淀用復溶緩沖液洗滌兩次，用體積為初始膠體金體積1/20的復溶緩沖液將沉淀重懸，得到的頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物溶液的濃度為50μg單抗/mL溶液，置4℃備用。

1.6 頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的凍干

向微孔試劑微孔板中加入100μL頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物，放入冷凍干燥機中，冷阱溫度為-70℃條件下，預凍4h后，再凍干14h，即可取出，得到凍干有頭孢類藥物單克隆抗體-膠體金標記物的微孔試劑。

1.7 樣品吸收墊的準備

將樣品吸收墊置于含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在緩沖液中的終濃度為體積百分含量0.5%）、pH為7.2、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液浸泡2h，37℃烘2h備用。

1.8 反應膜的制備

包被過程：用磷酸緩沖液將頭孢類藥物-牛血清白蛋白偶聯物稀釋到10mg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的檢測區，包被量為1.0μg/cm2；用0.01mol/L、pH7.4 PBS緩沖液將羊抗鼠IgG抗體稀釋到200μg/mL，用Biodot點膜儀將其包被于硝酸纖維素膜上的質控區，包被量為1.0μg/cm2。將包被好的反應膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

1.9 試紙條檢測方法

取所需數目的試紙條、微孔試劑、奶樣（液體）以及相關其他試劑恢復至室溫，吸取待檢牛奶樣品溶液，滴加200μL于微孔中，緩慢抽吸5次，充分與微孔中試劑混合，混合液顏色呈均勻粉紅色，開始計時。室溫下孵育5min，將標記好的試紙條插入微孔中（印有“max”線端朝下，使之充分浸入溶液中），微孔中的試劑與牛奶樣品反應，再次室溫孵育5min后，液體會沿著試紙條垂直向上依次通過試紙條的檢測線和對照線，當樣品中沒有β-內酰胺類抗生素時，試紙條的檢測線和對照線處出現紅色條帶；當樣品中存在β-內酰胺類抗生素時，試紙條的檢測線處不出現紅色條帶，僅對照線處出現紅色條帶，如圖1所示。

圖1 檢測結果示意圖Fig.1 Sketch of detection results

1.10 牛奶中β-內酰胺類抗生素測定

實驗測定β-內酰胺類抗生素試紙條靈敏度、特異性以及假陽性率和假陰性率。

1.1 0.1 試紙條檢測限測定 在空白牛奶樣品分別添加青霉素G標準品至終濃度分別為1、2、4μg/L；分別添加氨芐青霉素標準品至終濃度為2、4、8μg/L；分別添加阿莫西林標準品至終濃度為2.5、5、10μg/L；分別添加苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素標準品至終濃度為3、6、12μg/L；分別添加頭孢洛寧標準品至終濃度為5、10、20μg/L；分別添加萘夫西林和頭孢喹肟標準品至終濃度為10、20、40μg/L；分別添加頭孢曲松標準品至終濃度為10、25、50μg/L；分別添加頭孢哌酮標準品至終濃度為20、50、100μg/L；分別添加頭孢噻呋標準品至終濃度為45、90、180μg/L，取試紙卡進行測試，每個濃度重復測定5次，以驗證本試紙卡的檢測限。所用的稀釋液為pH7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液。

1.1 0.2 特異性實驗 特異性常用交叉反應率表示，是指抗體與結構不同的抗原決定簇發生結合的能力。將牛奶中常檢的其他藥物（克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龍醋酸酯、磺胺類、氯霉素類、大環內酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素類）用pH為7.2、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液進行稀釋，用試紙條進行檢測。

1.1 0.3 試紙卡的假陽性率、假陰性率測定 取空白牛奶樣品50份，計算出假陽性率。取添加青霉素G濃度為2μg/L的陽性牛奶樣品50份，計算出假陰性率。

2 結果與分析

2.1 試紙卡檢測限測定結果與分析

表1 試紙卡檢測限測定結果Table 1 The detection limit of strips

由上述測定結果可知，本試紙條對以下藥物的檢測限分別為：青霉素G2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素/鄰青霉素/雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L，都已達到了我國和歐盟規定的檢測限量要求。

2.2 試紙卡特異性結果及分析

結果顯示，克侖特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、三聚氰胺、群勃龍醋酸酯、磺胺類藥物、氯霉素類藥物、大環內酯類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、四環素類藥物在500μg/L濃度時，試紙條質控區和檢測區均顯色，由此可知本試紙條未對這些藥物發生交叉反應。

2.3 試紙卡的假陽性率、假陰性率測定結果及分析

表2 試紙卡假陽性率、假陰性率測定結果Table 2 The false positive rate and false negative rate of strips

所檢50份空白牛奶樣品的檢測結果1份陽性，其余均為陰性，試紙卡假陽性率不高于3%；青霉素G添加濃度為2μg/L的50份陽性樣品的檢測結果均為陽性，試紙卡假陰性率為0。

3 結論

通過實驗和測定結果顯示，本快速檢測試紙條用于測定牛奶中β-內酰胺類抗生素殘留可行，檢測限分別為：青霉素G 2μg/L、氨芐青霉素4μg/L、阿莫西林5μg/L、苯唑青霉素、鄰青霉素、雙青霉素均為6μg/L、頭孢洛寧10μg/L、萘夫西林20μg/L、頭孢喹肟20μg/L、頭孢曲松25μg/L、頭孢哌酮50μg/L、頭孢噻呋90μg/L，與牛奶中其他藥物不發生交叉反應，假陽性和假陰性的可能性較小，檢測時間短。可作為奶牛場、乳制品廠、政府監督部門、出入境檢測以及大型食品流通領域等篩查乳制品中β-內酰胺類抗生素的首選產品，使牛奶中抗生素問題得到有效監控，符合最大殘留限量標準。

[1]張繼明.β-內酰胺類抗生素的藥理研究進展[J].知識經濟，2009（7）：94.

[2]謝會玲，陳偉，彭池方，等.動物源性食品中β-內酰胺類抗生素多殘留免疫分析方法研究進展[J].食品科學，2008，29（7）：490-494.

[3]姜侃，陳宇鵬，金燕飛，等.應用酶聯免疫法快速檢測乳品中β-內酰胺類抗生素殘留[J].中國乳品工業，2010，38（1）：51-54.

[4]Janine Lamar，Michael Petz.Development of a receptor-based microplate assay for the detection of beta-lactam antibiotics in different food matrices[J].Analytica Chimica Acta，2007，586：296-303.

Development of the rapid detection strip for β-lactam antibiotics in dairy

LUO Xiao-qin，LIU Lin，LIU Wen-fang，CUI Yan-hu，YU Hou-mei
（Beijing Wanger Biotechnology Co.，Ltd.，Beijing 102206，China）

This study developed a strip which can detect β-lactam antibiotics in dairy products quickly，through producing class antibiotic rapid detection strip，through the synthesis of the conjugate of β-lactam antibiotics and carrier protein，preparation and purification of monoclonal antibody，preparation of colloidal gold markers，preparation of the conjugate of β-lactam antibiotics monoclonal antibody and colloidal gold markers，preparation of sample absorption mat and reaction film and any other process.The strip can detect for penicillin G 2μg/L，ampicillin 4μg/L，amoxicillin 5μg/L，oxacillin，cloxacillin，dicloxacillin 6μg/L，cefalonium 10μg/L，nafcillin，20μg/L，cefquinome 20μg/L，ceftriaxone 25μg/L，cefoperazone 50μg/L，ceftiofur 90μg/L，the detection sensitivity was respectively.The false positive rate was less than 3%，and the false negative rate was 0.The detection time was less than 15min.The reported results indicated that the developed assay had the potential to emerge into a screening assay for routine use.For this purpose current work was ongoing to include all beta-lactams for which MRLs were set，to extend the range of matrices and to perform a full validation according to the principles of EU decision. Key words：β-lactam antibiotics；dairy；colloidal gold；strips

TS252.7

A

1002-0306（2012）03-0309-04

2011－01－21

羅曉琴（1984-），女，本科，研究方向：食品安全與檢測。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2010AA10Z402）。