紅衣組分對花生分離蛋白及其酶解產物理化和抗氧化性質的影響

顧 煒，楊曉泉，*，劉遠洋，郭 健，任曉鳴

（1.華南理工大學輕工與食品學院，食物蛋白工程研究中心，廣東廣州510640；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

紅衣組分對花生分離蛋白及其酶解產物理化和抗氧化性質的影響

顧 煒1，楊曉泉1，*，劉遠洋2，郭 健1，任曉鳴1

（1.華南理工大學輕工與食品學院，食物蛋白工程研究中心，廣東廣州510640；2.黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶163319）

以花生為原料，研究了花生紅衣組分對花生分離蛋白及其酶解產物理化和抗氧化性質的影響。研究結果表明：含紅衣的分離蛋白酶解速度低于不含紅衣的；相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的；GPC分布中，含紅衣的峰值大于脫紅衣的；紅衣組分能夠提高花生分離蛋白及其酶解產物的溶解性、乳化穩定性、乳化活性；在相同水解度條件下，含紅衣的水解產物多酚含量顯著高于脫紅衣的，多酚含量的差異與花生分離蛋白及其水解產物的抗氧化性具有正相關性。

紅衣，花生分離蛋白，水解產物，理化性質，抗氧化活性

花生粕作為花生加工的副產物，在我國產量較為豐富，每年在花生榨油后，可得到約125萬t的花生粕[1]，花生粕含蛋白質40%以上[2]，在植物蛋白資源中，花生蛋白居第三位，占蛋白總量的11%，是較理想食用蛋白資源[3]。多酚類物質廣泛存在于植物體內，對植物蛋白的理化、營養及結構性質有著不容忽視的影響。國外文獻報道，多酚類物質能夠提高蛋白的溶解性[4]、乳化性和起泡性[5]、熱穩定性[6]；多酚類物質能夠提高蛋白的抗氧化性[7]，因此，系統地比較研究多酚對蛋白各方面性質的影響，對于植物蛋白改性、深加工都有重要意義。花生衣是花生產品的副產物，資源豐富，價格低廉，含有多種黃酮類多酚物質、具有抗氧化，阻礙蛋白糖化反應的作用[8-9]，從中提取的花生衣紅色素營養價值和醫用價值都很高，而且還具有良好的抗氧化能力，因此在食品、醫藥等行業中將有良好的應用前景[10]。本文以花生為原料，研究了花生紅衣組分對花生分離蛋白及其水解產物理化和抗氧化性質的影響，為植物蛋白理化功能性質的改善提供數據支持，對植物蛋白的深加工和相關的保健品開發都有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生 購于廣州市五山金莎超市；堿性蛋白酶 諾維信生物技術有限公司；所用化學試劑 均為分析純。

CR22G高速冷凍離心機 日本日立公司；Master2000粒度分布儀 英國Malvern公司；高效液相色譜儀Waters1525 美國Waters公司；熒光分光光度計F-7000 日本日立公司；紫外-可見分光光度計2501PC 日本島津公司；高壓微射流納米均質機M-110EH 美國Microfluidics公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 花生分離蛋白的制備 將脫紅衣和不同紅衣的花生用正己烷脫脂后，所得花生粕打粉，以1∶15（w/v）加入蒸餾水后調pH至9.0，室溫緩慢攪拌2h過篩，離心（6500×g，20min，25℃），取上清液調pH至4.5，離心（6500×g，20min，25℃），取沉淀以1∶10加水調pH至7.5透析，冷凍干燥得到花生分離蛋白樣品。

1.2.2 花生濃縮蛋白的限制性水解 配制濃度為2%的花生分離蛋白分散液于恒溫水浴中，加入一定量的堿性蛋白酶進行水解，根據pH-stat法[11-12]，用0.5N NaOH調節pH，繪制水解曲線。根據水解曲線，確定水解度為DH5、DH10和DH15的水解時間。

1.2.3 表面疏水性（H0） 表面疏水性的測定采用ANS熒光探針法[13]。將待測蛋白樣品溶于10mmol/L磷酸緩沖液（pH7.0）中，蛋白質濃度為1.5%（w/v）。向含4mL磷酸緩沖液的塑料離心管中分別添加10、20、30、40、50μL 1.5%的蛋白質溶液，在測試前添加20μL 8mmol/L ANS儲液，振蕩均勻，在8～15min內采用天美熒光分光光度計檢測樣品的熒光強度（FI）。激發和發射波長分別為390nm和470nm，激發和發射狹縫寬均為5nm。樣品的熒光強度值扣除試劑空白值即為蛋白的相對熒光強度值。以相對熒光強度對蛋白質濃度作圖，其初始段的斜率作為蛋白質的表面疏水性指數（H0）。

1.2.4 分子量分布的測定 采用凝膠過濾色譜（GPC）方法。用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）將樣品配制成質量濃度為5‰的溶液，攪拌1.5h，1000r/min離心，上清液過0.2μm過濾器，上樣量10μL，過G2000SWXL凝膠過濾柱，上樣后用50mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.2）洗脫，Waters1525高效液相色譜控制流速0.7mL/min，測定280nm波長處的吸光度。

1.2.5 溶解度曲線的測定[14]稱取8份100mg蛋白樣品分別分散于10mL的去離子水中，室溫下磁力攪拌30min，然后用1mol/L NaOH或HCl溶液調節溶液的pH到2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，再攪拌30min后，在20℃離心（12000×g，20min）。上清液經過適度稀釋后，采用Lorry法[15]測定蛋白質含量，以牛血清白蛋白（BSA）為標準物做標準曲線。蛋白質的溶解度表示為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比。

1.2.6 乳液粒度分布的測定 向10mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）中添加0.5%蛋白，10%油，通過微射流處理制備乳液，采用粒度分布儀測定乳液中粒子大小及其分布，計算表面積平均粒徑d3，2。

1.2.7 多酚（黃酮）含量的測定 參考Carbonaro等[16]的方法。用0.1mol/L的NaOH溶液配制1mg/mL的樣品溶液，充分振蕩混勻，10000×g離心15min，于328nm處測定吸光度A1（總多酚），之后加入5%質量分數的三氯乙酸（TCA），沉淀蛋白質，10000×g離心15min，于328nm處測定吸光度A2（游離多酚），A1-A2即為結合多酚對應的吸光度值。多酚含量以“g蘆丁當量/100樣品”為單位，通過以蘆丁為標樣的標準曲線計算。

1.2.8 DPPH·清除能力的測定 參考Shimada等[17]的方法。配制濃度為1mg/mL蛋白貯液，稀釋成濃度為0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的樣品溶液各2mL，加入0.2mmol/mL的DPPH乙醇溶液（現配）2mL，振蕩搖勻，在室溫下放置30min后，以無水乙醇為空白，于517nm處測定吸光值。DPPH·清除率（%）=[1-（AS/Ab）]×100%，式中，AS為樣品溶液對應吸光度值；Ab為蒸餾水對應吸光值。

2 結果與討論

2.1 紅衣組分對花生分離蛋白水解產物理化性質的影響

2.1.1 紅衣組分對花生分離蛋白水解曲線的影響 水解度（DH）變化曲線如圖1所示，在水解開始的1h內，DH增加最快，但是在3h到4h之間，隨著時間的增加，DH增加速度明顯減小。隨著E/S比例的提高，水解度DH增速在25min內明顯提高，在180min以后，增速明顯減小。比較脫紅衣、含紅衣的水解曲線，相同E/S比例、相同時間下，不含紅衣的水解度明顯高于含紅衣的水解度，說明經脫紅衣處理的分離蛋白更易被堿性蛋白酶水解。因為紅衣成分主要是多酚類物質，脫紅衣處理減少了多酚與蛋白的反應，使堿性蛋白酶的作用位點保持活性；同時較低的酚含量也降低了多酚與蛋白酶相互作用的幾率，Sripad[18]等研究表明多酚的存在對蛋白的酶水解有一定的抑制作用。

圖1 紅衣組分對花生分離蛋白水解曲線的影響Fig.1 Effect of peanut red skin on the hydrolysis curve of PPI at different E/S ratio

考慮到限制性酶解的可控性，若按E/S 2∶100或者4∶100進行酶解，在短時間內就達到DH5，不利于酶解時間的控制；同時為了節約酶制劑的使用量，本研究采用E/S 1∶100的水解度曲線進行限制性酶解，根據水解度曲線，分別酶解脫紅衣、含紅衣花生分離蛋白，以制備DH5、DH10、DH15的水解產物。

2.1.2 紅衣組分對水解產物表面疏水性的影響 圖2表明，水解產物的表面疏水性明顯減小，可能的原因是：酶解將球蛋白或者聚集體中的表面疏水基團降解了；滅酶過程中同樣會去除一些酶解產生的疏水性肽段或蛋白片段。圖中，DH15的疏水性指數大于DH5和DH10的疏水性，可能是隨著深度酶解的進行，酶解產生了更穩定的小分子量疏水性肽段。

圖2 花生分離蛋白及其水解產物的表面疏水性指數Fig.2 Surface hydrophobicity of PPI and its hydrolysates

比較脫紅衣、含紅衣分離蛋白及其水解產物的表面疏水性，相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的，因為紅衣里面多酚類物質跟部分表面疏水基團結合，從而降低了表面疏水性。

2.1.3 紅衣組分對水解產物GPC的影響 圖3中，花生分離蛋白及其水解產物的分子量分布結果表明，酶解以后分子量明顯減小，分離蛋白在9min處的吸收峰完全消失，而在17min處有一個較分離蛋白更大的吸收峰出現，說明酶解使得分離蛋白中的大分子變成了小分子，同時，隨著水解度的增大，17min處的峰也增大，說明水解度增大，小分子物質增多。

圖3 花生分離蛋白及其水解產物的分子量分布（GPC）Fig.3 GPC of PPI and its hydrolysates

不同樣品的上樣量均為10μL，相同水解度條件下，含紅衣分離蛋白及其水解產物的峰值大于脫紅衣，可能是因為圖4中含紅衣的溶解度大于脫紅衣的，樣品經離心處理后，含紅衣樣品中蛋白濃度大于脫紅衣的，從而導致在相同上樣量的條件下峰值也相應增大。

2.1.4 紅衣組分對水解產物溶解性的影響 文獻[19]報道花生多肽溶液能在較寬的pH范圍內保持溶解狀態，圖4顯示，酶解產物溶解度明顯高于花生分離蛋白，而且隨著水解度的增大，水解產物的溶解性也增大。相同水解度條件下，含紅衣分離蛋白及其水解產物的溶解性好于脫紅衣的，這跟文獻[4]報道的多酚類物質與蛋白作用能夠提高蛋白的溶解性相一致。

2.1.5 紅衣組分對水解產物乳化性的影響 乳狀液的粒度分布與表面積平均粒徑（d3，2）可表征樣品的乳化特性[20]。其中粒度分布在一定程度上可反映乳狀液的穩定性；乳狀液表面積平均粒徑（d3，2）的大小可反映樣品的乳化活性，一般d3，2較小則其乳化活性較好。

花生分離蛋白及其水解產物的乳狀液粒度分布變化見圖5，脫紅衣PPI的粒度分布呈雙峰分布，含紅衣PPI的粒度分布呈單峰分布，且平均粒度小于脫紅衣PPI，這表明紅衣組分能夠提高PPI的乳化穩定性。脫紅衣、含紅衣不同水解產物的粒度分布都呈雙峰分布，但含紅衣水解產物的平均粒度小于脫紅衣的水解產物，這說明紅衣組分也能夠提高水解產物的乳化穩定性。

圖4 花生分離蛋白及其水解產物溶解度的比較Fig.4 Solubility of PPI and its hydrolysates

圖5 花生分離蛋白及其水解產物乳狀液粒度分布的比較Fig.5 Particle size distribution of emulsions made with PPI and its hydrolysates

圖6 乳狀液表面積平均粒徑的變化Fig.6 Mean diameter per particle surface area of emulsions made with PPI and its hydrolysates

從圖6的表面積平均粒徑變化來看，相同水解度條件下，含紅衣水解產物的d3，2值小于不含紅衣，3d以后，含紅衣水解產物的d3，2增幅小于不含紅衣的。這表明紅衣成分能夠提高水解產物的乳化活性，與文獻[5]報道的多酚能夠提高蛋白的乳化性相一致。

圖6表明，DH5的d3，2值小于分離蛋白的d3，2值，說明DH5的乳化活性較強，這是因為限制性酶解將分離的剛性結果部分切割成柔性結構，使分子的結構變得柔軟，具有更高的乳化活性，但是隨著水解程度的進一步增大（DH10、DH15），水解蛋白分子變為更小的短肽，無法很好地在油水界面上形成具有一定粘彈性的界面膜以防止油滴聚集成大粒子，所以乳化活性與穩定性較差。

2.2 紅衣組分對花生分離蛋白水解產物抗氧化性的影響

2.2.1 紅衣組分對水解產物多酚含量的影響 圖7比較了花生分離蛋白在酶解過程中多酚含量及結合方式的變化，包括總酚含量、共價結合酚以及以弱電作用結合的游離酚含量，花生分離蛋白總多酚含量、游離多酚含量最多，水解產物總多酚含量、游離多酚含量減少。但是隨著水解度的增大，總多酚含量、游離多酚含量也增多。由于紅衣富含多酚類物質，所以相同水解度條件下，含紅衣的水解產物多酚含量顯著高于脫紅衣的。

圖7 花生分離蛋白及其水解產物的多酚含量比較Fig.7 Polyphenol contents of PPI and its hydrolysates

2.2.2 紅衣組分對水解產物DPPH·清除能力的影響圖8中，以抗氧化劑BHT為參比，BHT在0.1mg/mL時的清除率達到86%，遠高于同濃度下其他被測樣品的抑制率。相同水解度條件下，含紅衣水解產物的清除率明顯高于脫紅衣的，聯系多酚含量的分析數據可知（圖7），多酚含量的差異與花生分離蛋白及其酶解產物的DPPH·抑制率存在較大正相關性，較高的酚含量，尤其是游離酚含量有助于提高DPPH自由基清除率。

圖8 花生分離蛋白及其水解產物清除DPPH·能力比較Fig.8 DPPH·radical scavenging activity of PPI and its hydrolysates

酶解之后，分離蛋白對應酶解產物的清除能力均有所減弱，酶解產物中DH15的清除能力最強，含紅衣的樣品濃度達到1.0mg/mL時，DH15的DPPH·抑制率為46.9%。

3 結論

本研究比較了紅衣組分對花生分離蛋白酶解產物理化和抗氧化性質的影響，研究發現：紅衣的存在對蛋白的酶解有一定的抑制作用，含紅衣的分離蛋白酶解速度低于不含紅衣的；相同水解度條件下，含紅衣的表面疏水性小于脫紅衣的，GPC分布中，含紅衣的峰值大于脫紅衣的；紅衣組分能夠提高花生分離蛋白及其酶解產物的溶解性、乳化穩定性、乳化活性；在相同水解度條件下，含紅衣的酶解產物多酚含量顯著高于脫紅衣的，多酚含量的差異與花生分離蛋白及其酶解產物的抗氧化性具有正相關性，較高的酚含量，能提高DPPH自由基清除率。

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Effect of peanut red skin on the physicochemical and antioxidant properties of peanut protein isolate and its hydrolysates

GU Wei1，YANG Xiao-quan1，*，LIU Yuan-yang2，GUO Jian1，REN Xiao-ming1
（1.Research and Development Centre of Food Protein，College of Light Industry and Food Science，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China；2.College of Food Science，Heilongjiang August First Reclamation University，Daqing 163319，China）

Peanut was used as raw material，the effects of peanut red skin on the physicochemical and antioxidant properties of peanut protein isolate（PPI）and its hydrolysates were studied.The results showed that：the hydrolysis speed of PPI with peanut red skin was slower than PPI without peanut red skin；under the conditions of the same value of DH，surface hydrophobicity of PPI with peanut red skin was less than PPI without peanut red skin；in the distribution of GPC，the peak of PPI with peanut red skin was greater than PPI without peanut red skin；peanut red skin could improve the solubility，emulsion stability and emulsifying activity of PPI and its hydrolysates；under the conditions of the same value of DH，content of polyphenol of hydrolysates of PPI with peanut red skin was significantly increased，content of polyphenol had a positive correlation with antioxidant properties of PPI and its hydrolysates.

peanut red skin；peanut protein isolate；hydrolysates；physicochemical properties；antioxidant activities

TS201.2+1

A

1002-0306（2012）03-0106-05

2011－05－16 *通訊聯系人

顧煒（1986-），男，碩士，研究方向：蛋白質化學與工程。基金項目：廣東省重大科技專項（2009A080209001）。