基于模擬酶切的酪蛋白定向酶解探究

彭莉娟，王 偉，張賽賽，趙春江，馮鳳琴，*

（1.浙江大學生工食品學院，浙江杭州310058；2.浙江省農業科學院，浙江杭州310021）

基于模擬酶切的酪蛋白定向酶解探究

彭莉娟1，王 偉2，張賽賽1，趙春江1，馮鳳琴1，*

（1.浙江大學生工食品學院，浙江杭州310058；2.浙江省農業科學院，浙江杭州310021）

用模擬酶切軟件peptidecutter提供的39種蛋白酶，對已知序列的酪蛋白進行模擬酶切，以生成的寡肽數量為指標建立酶解肽庫，選擇適用酶并進行真實條件下的酶解驗證，獲得最適用酶；以血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽的抑制率和酪蛋白磷酸肽（CPP）的氮磷摩爾比來評價ACE抑制肽的活性及CPP的純度，超濾分離酶解液獲得高純度的ACE抑制肽和CPP。結果表明：胰蛋白酶為最適用酶，超濾后ACE抑制肽的抑制活性及CPP的純度顯著升高（p<0.01），獲得了高活性的ACE抑制肽和高純度的CPP。

酪蛋白，模擬酶解，血管緊張素轉化酶（ACE）抑制肽，酪蛋白磷酸肽（CPP）

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酪蛋白 臨夏州華安生物制品有限公司；馬尿酸、ACE、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL） sigma公司；胰蛋白酶（28萬U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；中性蛋白酶（15萬U/g）、堿性蛋白酶（4000U/g） 南寧龐博生物工程有限公司；乙腈 天津四友精細化學品有限公司，色譜純；其他化學試劑均為分析純。

LC-20AD液相色譜儀 日本島津公司；Kjeltec2300全自動定氮儀 丹麥FOSS公司；超濾裝置、膜包（PLCGC再生纖維素膜，截留分子量為1k和5k） 美國Millipore公司；PB-10 pH計、BSA224S電子分析天平 德國sartorius公司；DF101S磁力攪拌儀 中國英峪予華儀器廠；LXJ-IIB離心機 上海安亭科學儀器廠；DKS-24恒溫水浴鍋 中國中新醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肽數據庫的建立及優勢蛋白酶的選擇 從美國國立生物信息中心NCBI數據庫里選擇αs1、αs2、β和γ酪蛋白的序列，在peptidecutter中選用該軟件中提供的39種蛋白酶對每一條酪蛋白序列進行模擬酶切，酶解選擇所有蛋白酶分別酶解至少1次，最多10次，從模擬酶解結果中選擇含有10個氨基酸以下的寡聚肽建立肽庫。依據蛋白酶模擬酶解酪蛋白產物中少于10個氨基酸的寡聚肽數量，篩選最適蛋白酶。

1.2.2 酪蛋白的酶解 配制6%（m/v）的酪蛋白溶液，用10mol/L NaOH和1mol/L的NaOH調節pH穩定至最適值，置于恒溫水浴鍋中，加入一定量的酶（酶用量為2000U/g蛋白質）進行水解，磁力攪拌，用0.1mol/L NaOH維持pH在酶的最適pH±0.05范圍內，記錄加堿量和時間。反應一定時間后，沸水浴中滅酶10min，加入三氯乙酸，并使溶液的三氯乙酸的含量達15%[4]，冷卻至室溫，靜置10min，5000r/min下離心10min，取上清液，調pH至7.0，備用。

1.2.3 酶解液的超濾分離 操作壓力為0.1MPa，采用截留分子量為1k（膜材為再生纖維素）對酶解液進行分離，分子量大于1k的酶解液再采用截留分子量為5k的超濾膜包進行分離，得到分子量小于1k和1k～5k及大于5k的三部分酶解液，分別測定三部分酶解液的含氮量，加水調節使三部分的肽濃度至一致（2.36mg/mL），測定三部分的ACE抑制活性及N/P（mol/mol）。

1.2.4 蛋白質含量的測定[5]按GB/T 5009.5-2010，半微量凱氏定氮法，用全自動定氮儀分析。

1.2.5 磷含量的測定[6]按GB/T 5413.22-1997法。

1.2.6 水解度的測定 用pH-stat法[7]測定酪蛋白的水解度：

其中，htot為單位質量蛋白質中肽鍵的總量（mmol/g），酪蛋白為8.2；B為水解過程中所消耗的堿量（mL）；Nb為堿液的濃度（mol/L）；M為酶解液中蛋白質的質量（g）；α為α-氨基的平均解離度。

1.2.7 酪蛋白轉化率的測定 根據GB/T 22729-2008[4]低聚肽中酸溶蛋白質水解物含量測定方法來測定酶解液三氯乙酸可溶肽部分中的含氮量，計算公式為：

1.2.8 酶解液ACE抑制率的測定 根據Cushman和Cheung[8]等測定方法進行適當改進。吸取酪蛋白酶解液40μL，50μL 5mmol/L HHL和40μL硼酸緩沖液，37℃水浴5min，加入10μL 0.1U/mL的ACE，振蕩混勻，37℃恒溫反應30min，加入200μL 1mol/L HCl終止反應，用40μL pH8.3 0.1mol/L的硼酸緩沖液代替ACE抑制肽樣品進行空白對照實驗。反應液進行HPLC分析，HPLC條件為：流動相A為水溶液（含0.05%TFA和0.05%三乙胺），流動相B為乙腈，其中A∶B=75∶25；流速為0.5mL/min；進樣量為20μL；洗脫柱為Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×250mm，5μm，柱溫為25℃。

式中：A為空白對照實驗中馬尿酸的峰面積；B為添加ACE抑制肽組中馬尿酸的峰面積。

1.2.9 數據處理 數據處理采用DPS9.5進行顯著性分析。

2 結果與討論

2.1 肽庫的建立

2.1.1 肽庫的搜索結果 分別統計各種蛋白酶模擬酶解產物中10肽以下寡肽數量，其中能得到20個以上目標肽的蛋白酶如圖1。

圖1 不同蛋白酶酶解所得寡肽數量Fig.1 Peptide quantity of different enzymatic hydrolysis

由圖1可知，在39個蛋白酶中，酶解后產生活性寡肽數量最多的是胰蛋白酶，說明胰蛋白酶對酪蛋白具有比較好的降解能力，且酶解產物中目標肽較多，主要是由于胰蛋白酶具有水解專一性，切割酪蛋白后肽段既富含磷酸絲氨酸基團，同時又使肽段易于分離，胰蛋白酶的最適pH在中性稍堿性區域，而在此范圍內，酪蛋白可保持較大的溶解度，有利于反應的進行。堿性蛋白酶次之，中性蛋白酶位列第三，其原因可能是由于堿性蛋白酶較中性蛋白酶具有更廣泛的專一性，即酶切位點更多，因此酶切片段也較多。2.1.2 模擬酶解的蛋白酶特點 目前報道中酪蛋白酶法制備ACE抑制肽和CPP時常用的工具酶包括胰蛋白酶、堿性蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶、枯草蛋白酶，還有乳酸細菌發酵產生的蛋白酶。其中比較多使用的是胰蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶與堿性蛋白酶等[9]。

由肽庫分析預測結果篩選得到的三種較優水解用酶，分別是胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶，它們的作用特點如表1所列。由表1蛋白酶的酶切位點特性可知，胰蛋白酶的酶切位點在Arg和Lys的C末端。中性蛋白酶傾向于水解疏水性大分子氨基酸末端（如Trp、Val、Ile）。堿性蛋白酶是一種專一性廣泛的內切蛋白酶，水解位點多為疏水性氨基酸（如Ile、Phe、Tyr）。

表1 幾種特定蛋白酶的酶切專一性Table 1 Enzyme specificity of several specific protease

2.2 模擬酶解指導下水解用酶的選擇和確定

將肽庫分析預測結果篩選得到的三種較優的水解用酶（胰蛋白酶、堿性蛋白酶和中性蛋白酶）分別在各自最優酶解條件（如表2所示）下酶解至其最大水解度，再保溫10min，滅酶，將酶解液配制成相同的肽濃度（2.36mg/mL），比較不同部分酶解液的ACE抑制率。由表2可以看出，中性蛋白酶、堿性蛋白酶及胰蛋白酶間的ACE抑制率差異極顯著（p<0.01），其中胰蛋白酶酶解液的ACE抑制率為73.59%，在三種酶中表現最佳，因此確定胰蛋白酶為進一步實驗的水解用酶。

表2 蛋白酶的最適作用條件及酶解液的ACE抑制率Table 2 The optimum reaction conditions of protease and ACE inhibition rate of enzymatic hydrolysate

2.3 胰蛋白酶的水解度曲線及蛋白質轉化利用率

圖2 水解度隨時間的變化曲線Fig.2 Curves of hydrolysis degree changing with time

從圖2可以看出，胰蛋白酶的水解液在反應2h前水解度不斷增加，隨著時間的推移趨于平緩，究其原因，隨著酶解反應的進行：a底物濃度逐漸減小，反應位點被酶分子飽和；b酶活性在一定的溫度及pH下部分失活；c產物濃度的增加，導致其競爭性抑制變強；d中間復合物（ES）在經歷了初始階段的積累后達到穩定，趨于恒定[11]。

測得原料酪蛋白中的蛋白含量為9.20g，由凱氏定氮法計算得酶解上清液中的蛋白含量為8.32g，故酪蛋白的轉化利用率為90.32%，即在該酶解條件下大部分酪蛋白轉化為三氯乙酸可溶性肽，使原材料得到充分利用。

2.4 超濾分離前后酶解液ACE抑制率及磷酸肽N/P比較

表3 酶解液中的氮磷含量Table 3 Content of nitrogen and phosphorus in the enzymolysis liquid

根據相關報道，許多分子量小于1k的寡肽具有顯著的ACE抑制活性，如三肽IPP和VPP的IC50分別為5、9μmol/L[12-13]。代勇剛等[14]測得ACE抑制活性高達62.78%時的ACE抑制肽的相對分子質量在1500u以下。由于酪蛋白的序列上含有多個磷酸絲氨酰基，這些基團在酶解條件下帶有很強的負電荷，可以阻止酶的進攻和作用，因此，胰蛋白酶酶解液中高分子量部分即為人們熟知的CPP，據報道，其分子量分布范圍約為2000～4000u[15]。

圖3 分離前后酶解液ACE抑制率比較Fig.3 Comparison of hydrolysate ACE inhibition rate before and after separation

由圖3可以看出，超濾前后ACE抑制活性差異顯著（p<0.01），未經超濾分離的酶解液的ACE抑制率較低，經過膜分離后，小于1k的部分，ACE的抑制率有了顯著的提升，活性約是未超濾分離酶解液的6.10倍；而介于1k～5k部分的ACE抑制率較低，主要成分是酪蛋白磷酸肽，該部分N/P摩爾比值低至8.57，與超濾前差異顯著（P<0.01），酪蛋白磷酸肽的純度有了很大程度的提高。

國內外大量研究表明，CPP的平均分子量為3000左右時具有最佳的功能活性[16]。CPP中的N/P（mol/mol）能綜合反映CPP的鏈長和磷酸基密度，可以作為一個特性指標來衡量CPP的品質，研究發現，CPP中氮與磷的摩爾比值越小，CPP的肽鏈越短，磷酸基的密度越大，則CPP純度越高，促進鈣的吸收和利用作用也就越強[17]。馮鳳琴等[18]通過實驗測得商業化產品明治CPP-Ⅲ的N/P比為9.6。本實驗通過超濾膜分離，獲得了分子量小于1k的酶解液能顯著地提高酶解物的ACE抑制活性，使具有較高ACE抑制活性的肽類富集起來，通過1k和5k的超濾膜分離得到了高純度的CPP，達到了商品制劑水平。

3 結論

綜上所述，用peptidecutter提供的39種蛋白酶對已知氨基酸序列的酪蛋白進行模擬酶切，以生成的寡肽的數量為指標建立蛋白酶解肽庫，選擇適用酶并進行真實條件下的酶解驗證，獲得最適用酶。以ACE抑制肽的抑制率和CPP的N/P（mol/mol）來評價ACE抑制肽的活性及CPP的純度。結果表明：胰蛋白酶為最適用酶，在最適酶解條件下，酪蛋白的轉化利用率達90.32%，超濾前后ACE抑制肽的抑制活性及CPP中N/ P（mol/mol）差異極顯著（p<0.01），分子量小于1k的酶解液的ACE抑制活性得到顯著提高，分子量在1k～5k的酶解液的N/P（mol/mol）顯著降低，獲得了高活性的ACE抑制肽和高純度的達到商品制劑水平的CPP。本實驗應用模擬酶切指導蛋白質定向酶解，不僅提高了水解用酶的篩選效率，而且成功制備了高活性的生物活性肽，為工業化生產提供借鑒。

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Study on directed enzymatic preparation from casein based on simulated peptide-cut

PENG Li-juan1，WANG Wei2，ZHANG Sai-sai1，ZHAO Chun-jiang1，FENG Feng-qin1，*（1.Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China；
2.Zhejiang Academy of Agricultural Science，Hangzhou 310021，China）

Caseins with known sequences were simulated peptide-cut into small peptides by 39 kinds of proteases using the software of peptidecutter，and the suitable effective proteases were chosen in terms of the amount of oligo-peptides and enzymatic peptide library was established.The most effective protease was determined in the confirmatory experiment.AngiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory peptides（ACEIPs）and CPPs were obtained after ultra-filtration，and the inhibitory activity of ACEIP and the N/P ratio of CPP were used to assess the activity of ACEIP and the purity of CPP.The results implied that：the trypsin was chosen as the most suitable protease.Compared with the mixture before ultra-filtration，the activity of ACEIP and the purity of CPP were extremely significant improved（p<0.01）.In this way，higher activity of ACEIPs and higher purity of CPPs were obtained.

casein；simulated peptide-cut；angiotensinⅠ-converting enzyme inhibitory peptide；casein phosphopeptide

TS201.2+1

B

1002-0306（2012）03-0214-04

目前，獲得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白質水解酶和蛋白質來源的篩選以及酶解條件的優化上，研究者由于不知道原料蛋白的一級結構（即組成蛋白質的氨基酸序列）以及酶的專一性，往往是隨機選取蛋白質原料及蛋白質水解酶，通過對不同酶解液的活性比較來確定適宜的蛋白來源和酶種類，因而酶法生產活性肽往往存在一定的盲目性。一些研究者開始探尋新的方法，如黎觀紅等[1]利用Access數據庫軟件建立了一個生物活性肽數據庫，利用自編程序可用來尋找蛋白質中潛在的生物活性肽從該蛋白質中釋放出來的適宜的酶。陳征松等[2]建立了活性肽搜尋與蛋白模擬水解數據庫，實現了蛋白質用單酶或者復酶的模擬水解。Vanessa Vermeirssen等[3]建立蛋白質數據庫并進行了實驗，取得初步成果。目前ACE抑制肽和CPP是生物活性肽研究的重要內容，ACE抑制肽對血壓調節起著重要作用，CPP可以促進鈣的吸收和利用，因而在食品、醫療、保健等領域應用廣泛。本文選用氨基酸序列明確的酪蛋白為蛋白源，通過建立蛋白酶解肽庫，篩選最適蛋白水解酶，超濾分離獲得了高活性的ACE抑制肽和高純度的CPP。

2011－04－06 *通訊聯系人

彭莉娟（1986-），女，碩士，研究方向：功能性食品。

浙江省重大科技項目（2006C12096）；863項目（2008AA10Z313）。