一種釀酒酵母表達CDNA文庫分離纖維質降解酶系基因的方法

華承偉，謝鳳珍，于江傲

（1.河南科技學院生命科技學院，河南新鄉453003；2.河南科技學院新科學院，河南新鄉453003）

一種釀酒酵母表達CDNA文庫分離纖維質降解酶系基因的方法

華承偉1，謝鳳珍2，于江傲1

（1.河南科技學院生命科技學院，河南新鄉453003；2.河南科技學院新科學院，河南新鄉453003）

目的：建立一種篩選自然界產纖維質降解酶系基因的新方法。方法：對釀酒酵母表達載體pYES2多克隆位點加入真核生物稀有限制性酶切位點SfiI進行改造，利用SMART技術，以大腸桿菌文庫為轉導，構建了擬青霉（Paecilomyces sp.H28）的釀酒酵母全長cDNA表達文庫。結果：利用纖維質-剛果紅染色法從文庫篩選到多種纖維素和半纖維素降解酶系基因。結論：成功構建了擬青霉的釀酒酵母表達cDNA文庫，加快了纖維質降解酶系基因的快速分離，也為其它相關基因的快速分離提供了有益的借鑒。

釀酒酵母，表達cDNA文庫，纖維質降解酶，分離，擬青霉

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

擬青霉（Paecilomyces sp.H28） 由河南科技學院分離工程實驗室篩選并保藏；釀酒酵母INVSc1（Saccharomyces cerevisiae）及載體pYES2 Invitrogen；Escherichia coli strain JM109 Stratagene；無氨基酸酵母氮源（Yeast Nitrogen Base without Amino Acids，YNB） Difco；酵母提取物、胰蛋白胨 Oxoid；樺木木聚糖 Sigma；TRIzol ReagentInvitrogen；Oligotex mRNA Mini Kit Qiagen；PrimeScript Reverse Transcriptase（RNase H-），Advantage 2 PCR KitTaKaRa；T4 DNA連接酶及其它限制性內切酶 NEB；質粒提取試劑盒 北京天根生化科技；其它試劑 均為分析純。

1.2 pYES2載體的改造

1.2.1 寡核苷酸單鏈合成 根據pYES2載體酶切位點，分別合成內部具有EcoRI酶切位點且兩端帶有HindIII和XhoI兩個酶切位點粘末端及兩端分別引入SfiI A及SfiI B酶切位點的末端磷酸化的寡核苷酸鏈。

1.2.2 雙鏈DNA合成 用STE緩沖液溶解兩條寡核苷酸鏈，濃度為100μmol/L，分別取等體積的兩鏈溶液50μL混合，置于PCR儀上95℃加熱10min，然后緩慢冷卻到室溫，產物于4℃暫時貯存或-70℃保存。……