金線蓮揮發油成分的提取及其體外抗腫瘤作用研究＊

陳 焰 ，陳新峰 ，闕萬才 ，楊 菁

(1.福建省福清市第一醫院藥劑科，福建 福州 350300;2.福建醫科大學附屬協和醫院藥學部，福建 福州 350001)

金線蓮主要分布在我國亞熱帶地區，其中以閩、浙、贛、臺為主要產地，特別在臺灣地區備受青睞，被稱為“藥中之王”[1]。目前，我國對該植物的研究主要集中在人工栽培、組培、藥理等方面，而對其有效成分抗腫瘤作用的研究報道較少，限制了開發利用。本試驗中，應用水蒸氣蒸餾提取法對金線蓮中的揮發油成分進行提取分析，并研究其體外抗腫瘤活性，現報道如下。

1 儀器與材料

氣相色譜-質譜聯用儀(6890N網絡氣相色譜體系構建)，5975B InertxlMSD，進樣系統為7683B系列，均來自美國安捷倫公司;LC-2010C型高效液相色譜儀(日本島津);酶標儀450(美國Bio-Rad公司)。福建組培金線蓮鮮草(購自福建醫科大學附屬協和醫院中藥房);四甲基偶氮唑鹽(MTT，西格瑪公司)，RPMI 1640培養基(胎牛血清，批號為NVL0338);人肺癌細胞NCI-H446細胞，由福建醫科大學附屬協和醫院血液學研究所提供。

2 方法與結果

2.1 水蒸汽蒸餾法提取金線蓮揮發油

將新鮮的金線蓮用剪刀剪成約0.5 cm長的小段，精密稱取50 g，加適量水溶解，浸泡 24 h，用揮發油提取器提取 15 h，得到黃色的揮發油30 mg，加乙醚溶解并定容到2 mL容量瓶。揮發油提取率為0.06%。

2.2 色譜條件[2]

氣相色譜:色譜柱為DB-35MS石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm，0.25μm);載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min;分流進樣比為5∶1;進樣量為1μL;升溫程序為45℃保持7 min，以6℃ /min升溫到120℃(保持2min)，再以3℃ /min升溫到280℃，共計74min;進樣口溫度為250℃。

質譜:離子源為EI源;電子轟擊電壓70eV;離子源溫度為230℃;四極桿溫度為 150℃;傳輔線溫度為280℃;溶劑延遲4.0 min;質量掃描方式為全掃描(SCAN);掃描范圍1.6～500 amu;NIST107標準質譜檢索庫。

2.3 樣品測定

取備用樣品兩份，在上述氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)條件下，對水蒸氣蒸餾法提取金線蓮揮發油進行分析，得總離子流色譜圖(圖1)，檢出78個色譜峰。采用計算機對各峰質譜圖進行NIST標準質譜庫檢索和根據質譜裂解規律進行核對，鑒定了37個化合物，以十六羧酸甲酯、棕櫚酸為主，其次為亞油酸、亞麻酸甲酯和2-十二酮，其他成分多為飽和烷烴、脂肪酸、脂肪酸酯、醛、酮及酚。采用歸一化法計算各化合物的含量，占揮發油總量的96.26%。結果見圖1、圖2和表1。

圖1 金線蓮揮發油成分總離子流圖

圖2 金線蓮揮發油中十六羧酸甲酯質譜圖

2.4 人肺癌細胞NCI－H446細胞增殖能力影響試驗

取對數生長期的人肺癌細胞NCI-H446，接種于96孔培養板中，每孔200μL。試驗組加入不同質量濃度的金線蓮揮發油，使終質量濃度為 10，20，40，80，160，320 μg/mL。對照組加入等體積(含0.5%二甲基亞砜)培養液，每個質量濃度設3個復孔。37℃培養24 h或48 h后。每孔加入20μL MTT(5 g/L，pH為7.4的磷酸緩沖液配制)，繼續培養4 h。離心，棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜，微量振蕩儀振蕩10 min，立即用酶標儀在570 nm波長處測吸光度。計算抑制率和半數細胞抑制率(IC50):抑制率=1-(試驗組 OD值/對照組 OD值)×100%。以同一藥物的不同質量濃度對抑制率作圖，可得劑量反應曲線。根據線性回歸方程求出該藥物的 IC50，即細胞存活率減少50%時的藥物濃度。試驗重復3次[3]，結果見圖3。可見，金線蓮揮發油對人肺癌細胞NCIH446的抑制作用隨著時間和濃度的增加而升高。24 h和48 h時金線蓮揮發油對NCI-H446細胞的 IC50分別為70.17和122.85μg/mL。

表1 金線蓮中揮發油成分百分含量

圖3 金線蓮提取物對NCI-H446細胞的抑制作用

3 討論

采用水蒸氣蒸餾法提取福建組培金線蓮的揮發油成分中，以十六羧酸甲酯(47.98%)、棕櫚酸(20.57%)為主，其次為亞油酸(6.17%)、亞麻酸甲酯(4.07%)和2-十二酮(3.73%)。從海南栽培金線蓮中提取揮發油的主要成分為正十六烷酸、(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸、(Z，Z，Z)-9，12，15-十八碳三烯酸甲酯和(Z，Z)-9，12-十八碳二烯酸甲酯[4]。而從福建省漳州市金線蓮中提取揮發油的主要成分為十八烷酸和正十六烷酸[5]。尚未見從臺灣金線蓮揮發油中檢出十六酸甲酯與大量的烷烴類化合物的相關文獻。這提示不同地區的栽培金線蓮所含揮發性成分差異較大。因此，研究不同地區金線蓮揮發油中的主要成分，對于開發具有地方特色的中草藥意義重大。

將由福建組培金線蓮中提取的揮發油作用于人肺癌細胞NCI-H446 24 h或48 h以后，用MTT法檢測細胞的增殖活性。結果表明，金線蓮揮發油對人肺癌細胞NCI-H446有抑制作用，且抑制作用呈時間和劑量依賴性。

本試驗表明，金線蓮中的揮發油成分具有一定的抗肺腫瘤作用，是非常有前景的抗腫瘤藥物或輔助抗腫瘤藥物。筆者將進一步探討金線蓮揮發油抑制人肺癌細胞NCI-H446增殖的作用。

[1]孔祥海.“藥王”金線蓮的自然資源初步研究[J].中草藥，2001，32(2):155-157.

[3]曾慶華，呂新生，湯輝煥.MTT測定惡性腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[J].中國普通外科雜志，2000，9(6):552-554.

[4]韓美華，楊秀偉，靳彥平.金線蓮揮發油化學成分的研究[J].天然產物研究與開發，2006，18(1):65-68.

[5]蔡金艷，張勇慧，吳繼洲.藥王金線蓮揮發油及石油醚提取物的氣相色譜-質譜-數據系統聯用測定[J].時珍國醫國藥，2008，19(7):1 550-1 552.