大黃素在人肝腸微粒體的葡萄糖醛酸化反應

劉 薇， 王一飛△， 劉中秋

(1廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司，廣州 廣東 510632； 2南方醫科大學藥學院藥劑系，廣州 廣東 510515)

1000-4718(2012)09-1681-05

2012-04-10

2012-07-11

△通訊作者 Tel: 020-85220908 ; E-mail: twangyf@jnu.edu.cn

大黃素在人肝腸微粒體的葡萄糖醛酸化反應

劉 薇1， 王一飛1△， 劉中秋2

(1廣州暨南生物醫藥研究開發基地有限公司，廣州 廣東 510632；2南方醫科大學藥學院藥劑系，廣州 廣東 510515)

目的研究體外人肝腸微粒體孵育體系中大黃素的葡萄糖醛酸化代謝情況，并找出參與大黃素葡萄糖醛酸化代謝的人尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UGT)亞型。方法用超高效液相色譜法(UPLC)，檢測大黃素的葡萄糖醛酸化代謝情況，將代謝產物進行純化后，用質譜(MS)和核磁共振(NMR)法進一步鑒定其結構。用人的重組化表達的UGT單酶，鑒定可能參與大黃素葡萄糖醛酸化代謝反應的UGT亞型。結果大黃素葡萄糖醛酸代謝僅產生大黃素- 氧- 單葡萄糖醛酸這一個代謝產物。大黃素在人的肝、腸微粒體中的代謝屬經典的米氏方程動力學行為，除 UGT1A4和UGT2B17外，其它10種UGT亞型均參與了大黃素的葡萄糖醛酸化反應。結論大黃素在人肝腸微粒體孵育體系中會被代謝成為一個單葡萄糖醛酸化產物。大黃素的主要代謝部位是腸道。

大黃素; 葡萄糖醛酸化反應; 微粒體

大黃為蓼科多年生草本植物掌葉大黃、唐古特大黃或藥用大黃的干燥根及根莖，味苦性寒，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經的功用[1]。蒽醌類衍生物是大黃中主要的活性成分，主要有大黃素(emodin)、大黃酸(rhein)等，其中以大黃素的含量最高[2]。大黃及其含有蒽醌類成分的其它中藥如決明子、何首烏和蘆薈等也因其瀉下作用而被廣泛應用于具有減肥功能和清毒解熱的保健食品中[3-4]。我們研究發現，口服大黃素后血漿中的血藥濃度極低，而被葡萄糖醛酸轉移酶所代謝的大黃素葡萄糖醛酸苷的血藥濃度很高，Cmax是大黃素的30倍；靜注時大黃素亦可轉化為葡萄糖醛酸化產物[5]。 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-glucuronosyltransferases, UGTs)是藥物在機體中發生II相代謝反應時最重要的代謝酶[6]，將體內的葡萄糖醛酸與許多具有藥理活性的化合物發生結合反應。多酚類化合物或結構中有醇、硫醇、胺等基團的藥物能較易被UGT酶所代謝[7]。蒽醌類化合物大黃素是典型的多酚類化合物。葡萄糖醛酸化反應在蒽醌類化合物的代謝過程中發揮著重要的作用[8]。且大黃素的葡萄糖醛酸化產物的活性有可能比原型化合物更強，也有可能截然不同。考察大黃素在體外人肝、腸微粒體孵育體系中葡萄糖醛酸化代謝反應以及大黃素在人不同的UGT亞型中的代謝情況，為進一步理解大黃素在人體中的代謝行為以及大黃素的藥效學基礎提供實驗基礎和理論支持。

材 料 和 方 法

1藥品、試劑與儀器

大黃素對照品(純度>98%)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(uridine 5’-diphospho-glucuronic acid，UDPGA)、丙甲菌素, D-葡萄糖二酸-1，4-內酯等均購于Sigma; 人肝微粒體、人腸微粒體和12種人源重組UGTs(UGT1A1、UGT1A3、 UGT1A4、 UGT1A6、 UGT1A7、 UGT1A8、UGT1A9、UGT1A10、UGT2B4、UGT2B7、UGT2B15和UGT2B17)均購于BD Gentest。乙腈, 色譜純; MgCl2、NaCl、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜、醋酸銨以及其它試劑, 均為AR 級, 廣州化學試劑廠生產。超高效液相色譜-質譜聯用儀，Waters產品; 恒溫水浴箱, MS3 digital渦旋儀, IKA產品; 5424離心機, Eppendorf產品; NI-2RC 渦旋儀, 美國熱電儀器公司產品; 純水蒸餾器, Milipore產品。

2主要方法

2.1各種溶液的制備 (1)大黃素貯備液：精密稱取大黃素1.35 mg,以50%甲醇和50%乙醇的混合溶液配成1.35 g/L，即5 mmol/L的貯備液。實驗時, 用磷酸緩沖液稀釋成各種濃度。(2)溶液A(solution A)：二磷酸尿苷葡萄糖醛酸25 mmol/L即807.75 mg溶于50 mL雙蒸水中，混勻至完全溶解。每管分裝1 mL，標記好，放置4 ℃冰箱備用。(3)溶液B(solution B)：MgCl219.042 mg溶于40mL 雙蒸水中，至溶解；5 mg丙甲菌素溶于100 μL甲醇中，全部移至40 mL MgCl2中，超聲10～20 min。210 mg D-葡萄糖二酸1，4-內酯溶于40.1 mL的混合溶液中，渦旋至溶解即可。每管分裝1 mL，標記好，放置4 ℃冰箱備用。(4)KPI溶液(磷酸緩沖溶液)：取磷酸氫二鈉68.9 g和磷酸二氫鈉78.9 g, 加蒸餾水至1 000 mL, 用NaOH 調pH為7.2。

2.2大黃素葡萄糖醛酸化反應(微粒體酶反應) 從-20 ℃冰箱取出溶液A、溶液B、微粒體(或UGT酶)和磷酸緩沖液放置37 ℃水浴上解凍，大黃素貯備液用磷酸緩沖液稀釋至4 mmol/L、3 mmol/L、2 mmol/L、1.5 mmol/L、1 mmol/L、0.75 mmol/L、0.5 mmol/L、0.25 mmol/L、0.125 mmol/L等從高到低9個濃度。向EP管中分別依次加入磷酸緩沖液421.2 μL、溶液B、微粒體或UGT酶、不同濃度的藥物和溶液A，關上蓋子，用力渦旋30 s，再將每個管中的混合溶液分裝成另外3個管，每管200 μL，迅速放入37 ℃水浴鍋孵育10 min，取出，重新放置冰浴上，往每管加入100 μL含睪丸酮(50 μmol/L)的乙腈溶液，終止反應。13 000 r/ min 離心 15 min，取上清液10 μL進樣UPLC。

2.3分析條件 色譜條件：色譜柱：BEH C18，1.7 μm, 2.1×50 mm。流動相：乙腈(B)與2.5 mmol/L醋酸銨水溶液，pH 7.4 (A)；梯度洗脫：0 ～ 0.1 min， 85%A，0.1～1.8 min，85%～60%A，1.8 ～ 2.2 min，60%～40%A，2.2～2.8 min，40%～85%A，2.8～3.2 min，85%A；流速：0.4 mL/min。檢測波長：254 nm；進樣體積10 μL。色譜系統：Waters ACQUITY UPLC with Photodiode Array Detector and Empower software。質譜條件：離子源為電噴霧離子源(electrospray ionization, ESI)，采用負離子檢測方式，毛細管電壓4.5 kV，離子源溫度350 ℃，離子源噴射電壓4.5 kV，去溶劑溫度 108 ℃，霧化氣流(氣流1)為氮氣，40 psi，離子源氣流(氣流2)為氬氣，20 psi。采用一級全掃描質譜及選擇離子全掃描二級質譜(full scan MS2)兩種方式同時測定。核磁條件：Bruker 400 MHz。

3統計學處理

結 果

1UPLC法鑒別大黃素及其二相代謝結合物

大黃素在人的肝、腸微粒體以及UGT酶的孵育體系下反應后，均產生了同一個新的化合物，在1.92 min時出現了一個新的峰，見圖1A，大黃素和內標液的保留時間分別為2.77 min和2.42 min。利用紫外檢測器對此峰進行PDA掃描，可見此物質有2個最大吸收波長，分別是225.2 nm和262.9 nm。與原形藥物的紫外PDA圖譜相對比，大黃素有3個吸收波長：230.5 nm、253.5 nm和291.3 nm。兩者的吸收波長相似，可以初步判定，這個新的產物是大黃素的衍生物,見圖1B。

Figure 1. UPLC chromatogram (A) and UV spectrum (B) of emodin and its metabolite after incubated with various microsomes. M: metabolite; IS: internal standard.

圖1經微粒體孵育后大黃素及其代謝產物的UPLC色譜圖和紫外圖譜

2LC/MS/MS鑒別大黃素的二相代謝結合物

大黃素經人肝、腸微粒體以及UGTs酶孵育后，其代謝產物的質譜分析見圖2，此物質的質譜圖顯示樣品產生的分子離子質荷比m/z為445.0780，計算推導所得的分子式為C21H17O11分子量445.0776)，與大黃素的分子量與葡萄糖醛酸分子量之和相吻合，可推斷為(大黃素-葡萄糖醛酸結合物-H)-，另一主要的分子離子峰在質荷比269.0462，可推斷為(大黃素葡萄糖醛酸結合物-葡萄糖醛酸)-，與大黃素分子量-H相吻合。

Figure 2. Mass spectrum of emodin glucuronide.

圖2大黃素二相代謝產物(大黃素葡萄糖醛酸結合物)質譜圖

31H-NMR法確定大黃素葡萄糖醛酸結合物結構式

大黃素與其葡萄糖醛酸結合物的一維核磁共振氫譜(1H-NMR)圖表明，兩者氫譜上的信號十分相似，但后者發現了糖基的化學位移值(δ)變化，如H-1’ 上δ5.14 (1H, d,J=8 Hz) 和 H-5’ 上的δ4.21 (1H, d,J=8 Hz)，可以判定葡萄糖醛酸上的這兩個H的位置與大黃素結合位置有關。從大黃素的葡萄糖醛酸結合物的二維ROSEY(見圖3)氫譜中可以看出，在化學位移值H-4 (δ7.45) 和H-2 (δ6.96) 都與糖基上的H1’ (δ5.14) 有關，可以確定，葡萄糖醛酸結合在大黃素的3位羥基上(3-OH)。因此大黃素經UGTs代謝途徑得到的II相代謝產物為大黃素-3-O-葡萄糖醛酸(emodin 3-O-β-D-glucuronide)，見圖3B。

Figure 3. NOESY spectrum (A) and structure formula (B) of emodin glucuronide. The nuclear Overhauser effect (NOE) was related to anomeric proton, H-2 and H-4.

圖3大黃素葡萄糖醛酸結合物的二維NOESY氫譜圖和結構式

4大黃素在人的肝、腸微粒體中代謝的酶動力學考察

我們考察并計算了大黃素在人的肝、腸微粒體的酶動力學參數，并繪制出Eadie-Hofstee 圖以確定藥物代謝的種類。大黃素與葡萄糖醛酸結合的結合速率與大黃素濃度的酶促動力學曲線見圖4，結果顯示大黃素的代謝在其高濃度的時候呈現飽和現象，Eadie-Hofstee圖見圖4中的插圖，從圖上可以看出大黃素無論在人肝微粒體還是腸微粒體中的代謝符合典型的米氏方程。

圖4大黃素在人肝微粒體和腸微粒體中葡萄糖醛酸化反應的酶促動力學曲線

5人的12種UGT同工酶對大黃素的葡萄糖醛酸化的影響

我們選取了高、中、低3個濃度的大黃素(2.5、10、40 μmol/L)，分別考察它們在不同人的UGT同工酶中的代謝速率的差異。大黃素濃度在2.5 μmol/L時不同的UGT同工酶對其催化反應速率，快慢的排列順序依次為：UGT1A10[(4.30±0.98) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A9[(1.74±0.23) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A8[(1.47±0.08) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A1[(1.28±0.03) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT2B7[(1.19±0.04) μmol·(g protein)-1·min-1] >UGT1A7[(0.58±0.03) μmol·(g protein)-1·min-1]；大黃素濃度在10 μmol/L時不同的UGT同工酶對其催化反應速率，快慢的排列順序依次為：UGT1A10[(8.35±1.40) μmol·(g protein)-1·min-1] >UGT1A9[(4.00±0.29) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A8[(3.98±0.70) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT2B7[(2.50±0.15) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A1[(2.15±0.79) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A7[(1.31±0.25) μmol·(g protein)-1·min-1]；大黃素濃度在40 μmol/L時不同的UGT同工酶對其催化反應速率，快慢的排列順序與10 μmol/L大黃素相同，依次為：UGT1A10[(10.96±0.80) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A9[(5.40±0.60) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A8[(4.87±0.31) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT2B7[(3.17±0.13) μmol·(g protein)-1·min-1]≈UGT1A1[(2.81±0.49) μmol·(g protein)-1·min-1]>UGT1A7[(2.13±0.20) μmol·(g protein)-1·min-1](P<0.05)。因此無論大黃素的濃度如何， UGT1A10、1A9、1A8、2B7和1A1始終是最重要的代謝大黃素的幾個同工酶。

討 論

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌)是有著3個酚羥基的蒽醌類化合物，因此其羥基位置極易與葡萄糖醛酸結合，我們先后使用了人的肝微粒體、人的腸微粒體和人的重組化UGTs酶等對大黃素進行孵育實驗，色譜和質譜結果證明大黃素極易被代謝成大黃素-葡萄糖醛酸化物，而且不同的肝腸微粒體酶代謝反應產生的新化合物均在同一時間出峰，證明生成的代謝產物為同一化合物，經核磁氫譜的結果判定此化合物為大黃素-3-O-葡萄糖醛酸。而大黃素的幾種相似物如大黃酸等，我們前期實驗也進行了肝微粒體孵育實驗，但都未見有新的化合物產生，究其原因，它們的蒽醌母核在3位上均無酚羥基，這也可能是這幾類藥物無法產生葡萄糖醛酸化反應的原因。

近年來，人們對大黃蒽醌類化合物的代謝過程越來越重視，大黃的安全性亦日益倍受關注。美國NIH對大黃素和大黃蒽醌進行長達2年多的實驗研究發現，在飼料中添加一定量大黃素，對F344/N雌性大鼠有誘發腺癌的可能[9]。因此，了解大黃蒽醌類化合物的代謝特點能夠使我們更清楚地了解該類化合物發揮藥效的物質基礎，將極大地促進大黃素等化合物的藥用開發。葡萄糖醛酸化結合反應是單羥基和多羥基蒽醌類藥物的主要代謝通路[10]。在我們前期對大黃素的藥代動力學研究表明其大黃素口服給藥大鼠后，主要以葡萄糖醛酸化代謝產物的形式進入體循環[5, 11]。Teng等[12]研究了大黃素在人結腸癌細胞(Caco-2)中的代謝情況發現，主要代謝途徑為葡萄糖醛酸化代謝，其次是磺酸化代謝。而我們在之前的研究也發現細胞色素P450 介導的氧化代謝很弱，說明葡萄糖醛酸化代謝是大黃素體內主要代謝途徑。

目前鮮有報道大黃素在UGT1A或UGT2B亞家族中代謝研究。本實驗填補了這一空白，我們將這兩大家族聯系在一起進行系統的研究，能進一步地促進我們對大黃素代謝過程的了解。從結果中可以看出UGT1A 家族對大黃素的葡萄糖醛酸結合反應起著主要作用，特別是UGT1A10、UGT1A9、UGT1A8和UGT1A1。而這些UGT的亞型與兩個最重要的代謝場所有關，UGT1A1在肝腸中都有分布，UGT1A9只在肝中表達，而UGT1A10、UGT1A8只在腸中表達。而UGT1A10對大黃素的代謝最快，和我們之前推斷的腸道是大黃素的主要代謝場所相吻合。

可以非常肯定的是，大黃素的極低生物利用度與其溶解度低、在體內易與葡萄糖醛酸結合而極性增強排出體外有直接的關系。

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Glucuronidationofemodininhumanliverandintestinalmicrosomes

LIU Wei1, WANG Yi-fei1, LIU Zhong-qiu2

(1GuangzhouJinanBiomedicineResearchandDevelopmentCenter,Guangzhou510632,China;2DepartmentofPharmaceutics,SchoolofPharmacy,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,China.E-mail:twangyf@jnu.edu.cn)

AIM: To investigate the glucuronidation of emodin in human liver and intestinal microsomes, and to elucidate the UDP-glucuronosyltransferase (UGT) isoforms involved in emodin glucuronidation.METHODSAfter incubation of emodin usinginvitrohuman liver or intestinal microsomal system,ultra-performance liquid chromatography (UPLC) was utilized to determine the glucuronides of emodin. Mass spectrum(MS) and nuclear magnetic resonance(NMR) were employed to elucidate the structures of metabolite. Screening assays with recombinant human UGTs were used to identify the UGT isoforms involved in the glucuronidation of emodin.RESULTSOnly one metabolite was identified and elucidated to be emodin-O-monoglucuronide. The metabolic behavior of emodin was followed typical monophasic Michaelis-Menten kinetics. Except UGT1A4 and UGT2B17, the other 10 UGTs were determined to participate in the glucuronidation of emodin.CONCLUSIONEmodin-O-monoglucuronide is the only metabolite of emodin in the incubation system of human liver and intestinal microsome. Different microsomes are responsible for the metabolism of emodin in different organs/regions of the digestive system. The glucuronidation of emodin in the intestine contributes significantly to that of emodin in the liver.

Emodin; Glucuronidation; Microsomes

R329.21

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.09.025