胰腺癌相關糖尿病的血清蛋白質組學分析

吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

·論著·

胰腺癌相關糖尿病的血清蛋白質組學分析

吳健婷 田字彬 丁雪麗 荊雪 江月萍 魏良洲 孔心涓 張翠萍 趙清喜

目的檢測胰腺癌相關糖尿病的血清蛋白標志物，并建立診斷模型。方法應用表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測17例胰腺癌相關糖尿病與17例新發2型糖尿病、17例健康對照者血清的差異表達蛋白，用Biomarker Patterns Software 5.0軟件建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型并驗證。結果在胰腺癌相關糖尿病、新發2型糖尿病、健康者各10例的蛋白指紋圖譜中篩選出12個差異表達蛋白峰，其中質荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型的蛋白峰。該診斷模型的診斷正確率為90%。盲法驗證各組另7例樣本，正確診斷胰腺癌相關糖尿病患者達100%，新發2型糖尿病患者為71%，健康人群為86%。經檢索蛋白質數據庫，與以上3種差異表達蛋白分子質量最為接近的蛋白分別為金屬硫蛋白、胰腺干細胞增殖分化因子和成纖維細胞生長因子1。結論通過SELDI方法篩選出3種胰腺癌相關糖尿病的血清蛋白標志物，建立了可靠的胰腺癌相關糖尿病的診斷模型。

糖尿病； 胰腺腫瘤； 蛋白質組學； 表面增強激光解析電離飛行時間質譜技術

有學者[1-3]認為，新發糖尿病(病程≤2年)是胰腺癌的早期臨床表現，可將新發糖尿病患者作為篩查胰腺癌的高危人群。但新發糖尿病中，多數為新發的2型糖尿病，只有較少部分由胰腺癌引起，稱為胰腺癌相關糖尿病。若在新發糖尿病患者中篩查出胰腺癌相關糖尿病，則有可能實現胰腺癌的早期診斷。本研究比較胰腺癌相關糖尿病患者與相應對照患者的血清蛋白質譜差異，篩選胰腺癌相關糖尿病的血清蛋白標志物，以期為胰腺癌相關糖尿病的鑒別診斷和發病機制的探討提供依據。

材料與方法

一、臨床資料

2011年5月至2011年12月間采集青島大學醫學院附屬醫院收治的17例胰腺癌相關糖尿病、17例不合并糖尿病的胰腺癌、5例胰腺癌合并長期糖尿病、17例新發2型糖尿病患者及17例在體檢中心體檢的健康者全血標本5 ml，立即放入4℃冰箱靜置3 h，4℃離心取血清，按每管50 μl分裝后置-80℃冰箱保存。胰腺癌相關糖尿病組與其他各組患者的年齡、性別相匹配。胰腺癌診斷均經病理檢查證實。糖尿病診斷標準參見1997年美國糖尿病協會推薦的標準[4]。胰腺癌相關糖尿病：胰腺癌合并病程≤2年的糖尿病。新發2型糖尿病：病程≤2年的2型糖尿病，且除外胰腺癌可能。長期糖尿病：病程>5年的2型糖尿病，且除外胰腺癌可能。

二、血清蛋白指紋圖譜檢測

采用表面增強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測。具體操作：將血清冰浴融化后置4℃ 10 000 r/min離心2 min，取血清10 μl，加入20 μl U9緩沖液(9 mol/L尿素、20 g/L CHAPS、10 g/L DTT、50 mmol/L Tris-HCL，pH9.0)，充分混勻振蕩30 min，加入50 mmol/L NaAc(pH4.0)370 μl，混勻。取50 g/L的弱陽離子WCX型納米磁珠(北京賽爾迪生物技術有限公司)50 μl，加入PCR管中，加入100 μl NaAc混勻、活化5 min后于磁性分離板上放置2 min，棄上清液，重復上述操作1次。

每份棄上清液活化的磁珠中加入100 μl處理好的血清樣本，充分振蕩混勻，室溫孵育30 min，磁性分離板上放置1 min，棄上清液。用100 μl NaAc洗脫2次，每次5 min，加入10 μl TFA洗脫結合在磁珠上的血清蛋白。5 min后取5 μl蛋白洗脫液，加入5 μl SPA，充分混勻后吸取2 μl混合液點樣于金芯片(Au Chip)，自然晾干。

應用PBSⅡ-C蛋白質芯片時間飛行質譜儀(美國Ciphergen公司)檢測血清蛋白。設定最高檢測分子質量為50 000，優化范圍為1500～20 000，激光強度為260，檢測敏感度為8。濾去分子質量10 000以下的峰，以免基質峰對結果造成干擾。檢測前用All-in-one多肽標準芯片校正儀器，系統質量偏差≤0.1%。

三、胰腺癌相關糖尿病診斷模型建立

采用Biomarker Patterns Software5.0識別診斷胰腺癌相關性糖尿病的最佳標志物，建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型。對建立診斷模型的差異蛋白峰進行蛋白質數據庫檢索(http://us.expasy.org/tools/tagident.html)，以尋找與其分子質量最為接近的蛋白質。

四、統計學處理

采用Ciphergen proteinchip3.1分析軟件自動采集數據，不同組之間蛋白峰峰值的差異采用Biomarker Wizard行t檢驗。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

一、胰腺癌相關糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜的比較

胰腺癌相關糖尿病組與胰腺癌合并長期糖尿病組、胰腺癌不合并糖尿病組、新發2型糖尿病組、健康對照組的血清蛋白質指紋圖譜見圖1。胰腺癌相關糖尿病組的質荷比為8455 Da的蛋白峰表達顯著高于其他各組(P<0.05)。

1、2：胰腺癌相關糖尿病；3、4：胰腺癌不合并糖尿病；5：胰腺癌合并長期糖尿病；6、7：新發糖尿病；8、9：健康對照

圖1胰腺癌相關糖尿病組與其他各組的蛋白指紋圖譜

二、胰腺癌相關糖尿病組與新發2型糖尿病組、健康對照組的比較

按數字表法在胰腺癌相關糖尿病組、新發2型糖尿病組、健康對照組中各選取10例組成建模組，發現12個蛋白峰峰值的差異具有統計學意義(P<0.05，表1)，其中質荷比為6116、6695、8936 Da的蛋白峰被選為建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型的蛋白峰。各組質荷比為6116 Da的蛋白峰見圖2。

質荷比(M/Z)胰腺癌相關糖尿病新發2型糖尿病健康對照P值6116a3.23±1.6532.00±1.236.45±2.620.00085591218.39±17.2215.34±13.4158.50±27.890.001076695a1.99±0.990.90±0.301.76±0.770.0040281367.47±5.8011.15±12.903.10±1.330.007248936a10.83±5.668.44±5.614.70±2.840.0081916819.75±5.196.24±3.1313.14±5.420.0103729583.25±3.203.17±3.258.10±4.530.0128855500.86±0.820.60±0.311.63±0.810.01413332940.30±0.120.41±0.310.76±0.490.0206565011.51±1.310.93±0.342.07±1.040.0318617422.18±1.411.73±1.774.42±3.520.04444116684.58±2.485.91±3.492.85±1.920.04692

注：a被選為建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型的蛋白峰

1、2：胰腺癌相關糖尿病；3、4：新發2型糖尿病；5、6：健康對照

三、胰腺癌相關糖尿病診斷模型流程

以6116 Da蛋白為節點 1，將30例中峰值>5.94的7例劃分到終節點4中，為健康人群；峰值≤5.94的23例樣本再以6695 Da蛋白為節點2繼續劃分，峰值≤1.24的11例劃分到終節點1中，診斷為新發2型糖尿病；峰值>1.24的12例以8936 Da蛋白為節點3繼續劃分，峰值≤3.52的2例劃分到終節點2中，為健康人群，峰值>3.52的10例劃分到終節點3中，診斷為胰腺癌相關糖尿病(圖3)。其診斷ROC曲線見圖4。

紅色條為健康對照，藍色條為新發糖尿病，綠色條為胰腺癌相關糖尿病

圖3胰腺癌相關糖尿病診斷模型圖

圖4 胰腺癌相關糖尿病診斷模型ROC曲線

四、診斷模型的盲法驗證

采用已建立的診斷模型對建模組30例及另21例蛋白指紋圖譜進行盲法驗證，結果顯示建模組30例的診斷正確率均達90%，另21例中胰腺癌相關糖尿病診斷率為100%，新發糖尿病診斷準確率為71%，健康人群為86%(表2)。

表2 診斷模型的盲法驗證結果

五、蛋白質數據庫查詢

對建立胰腺癌相關糖尿病診斷模型的3個差異蛋白峰分別進行數據庫檢索，6116 Da蛋白與金屬硫蛋白(6115 Da)的分子質量最為接近，8936 Da蛋白與胰腺干細胞增殖分化因子(8933 Da)的分子質量最為接近，6695 Da蛋白與成纖維細胞生長因子1(FGF1，6698 Da)的分子質量最為接近。

討 論

胰腺癌的早期診斷一直是臨床工作中亟待解決的問題，目前常用的胰腺癌血清學標志物因其靈敏性和特異性欠佳，不能滿足早期診斷胰腺癌的需要。近年來，以新發糖尿病為胰腺癌高危人群，從中篩查胰腺癌相關糖尿病為胰腺癌的早期診斷提供了新的思路。目前關于胰腺癌相關糖尿病發病機制主要是胰腺癌釋放的可溶性介質干預胰島β細胞功能，影響肝臟、肌肉的糖代謝過程，引起胰島素抵抗，最終導致胰腺癌相關糖尿病的發生[5]。對于可溶性介質的研究主要集中在體外細胞培養、組織標本檢測、基因組學研究等方面。

近年來，蛋白質組學得到迅速發展。SELDI是蛋白質組學技術之一，在腫瘤標志物的探索方面得到廣泛應用。本研究發現，在胰腺癌相關糖尿病組與新發2型糖尿病組、健康對照組間有12個蛋白峰峰值存在統計學差異，其中6116、8936和6695 Da的蛋白峰為診斷胰腺癌相關糖尿病的最佳標志物。以此為依據建立的診斷模型診斷正確率為90%。盲法驗證顯示，該模型可正確劃分100%的胰腺癌相關糖尿病患者、71%的新發糖尿病患者和86%的健康人群。本研究還顯示，質荷比為8455 Da的蛋白峰在胰腺癌相關糖尿病組與其他組的差異亦具有統計學意義，但在建模組間未發現顯著差異，其原因有待進一步擴充樣本量后驗證。

6116 Da蛋白峰與金屬硫蛋白分子質量最為接近。研究發現，金屬硫蛋白具有清除自由基、減輕高血糖及脂肪酸的細胞毒性、改善胰島素抵抗從而延緩糖尿病發生的作用[6]。8936 Da蛋白峰與胰腺干細胞增殖分化因子與的分子質量最為接近。6695 Da蛋白與FGF1蛋白的分子質量最為接近，FGF1可改善胰島β細胞功能，促進胰島素分泌，促進脂肪合成[7]。本實驗顯示，胰腺癌相關糖尿病患者血清6116 Da、6695 Da蛋白表達下調，8936 Da蛋白表達上調，它們參與胰腺癌相關糖尿病的發病機制尚待進一步研究。

由于本實驗采用SELDI技術，它所得到的每一個波峰值對應的可能是多個分子質量相近的蛋白質或多肽，因此，并不能對目標蛋白做直接鑒定，依據其分子質量在蛋白質數據庫檢索所得結果只是一種可能性猜測，因此對所篩選到的差異表達蛋白尚需進一步明確。

[1] Pannala R, Basu A, Petersen GM, et al. New-onset diabetes:a potential clue to the early diagnosis of pancreatic cancer. Lancet Oncol,2009,10:88-95.

[2] Ben Q, Cai Q, Li Z, et al.The relationship between new-onset diabetes mellitus and pancreatic cancer risk:a case-control study. Eur J Cancer,2011,47:248-254.

[3] Chari ST, Leibon CL，Rabe KG，et al．Pancreatic cancer-associated diabetes mellitus: prevalence and temporal association with diagnosis of cancer. Gastroenterology,2008,134：95-101．

[4] Report of the Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus.Diabetes care,1997,20:1183-1197.

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[6] Park L, Min D, Kim H,et al.Tat-enhanced delivery of metallothionein can partially prevent the development of diabetes.Free Radic Biol Med，2011，51:1666-1674.

[7] Hart AW, Baeza N, Apelqvist A,et al.Attenuation of FGF signaling in mouse β-cells leads to diabetes.Nature,2000,408:864-868.

Serumproteomicanalysisofpancreaticcancerassociateddiabetes

WUJian-ting,TIANZi-bin,DINGXue-li,JINGXue,JIANGYue-ping,WEILiang-zhou,KONGXin-juan,ZHANGCui-ping,ZHAOQing-xi.

DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofQingdaoUniversityMedicalCollege,Qingdao266003,China

TIANZi-bin,Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

ObjectiveTo detect serum biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and establish a model for diagnosis.MethodsSELDI-TOF-MS was used to detect the differentially expressed serum proteins from 17 pancreatic cancer associated diabetes patients, 17 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 17 healthy controls, then a model of biomarkers was constructed and validated by Biomarker Patterns Software 5.0.ResultsTwelve discriminating m/z peaks were identified in the protein fingerprints in 10 pancreatic cancer associated diabetes patients, 10 new-onset type Ⅱ diabetes patients and 10 healthy controls. Among them, the three biomarkers of mass/charge ratio 6116, 6695 and 8936 were used to construct the model, which could diagnose 90% pancreatic cancer associated diabetes form control groups. Blind test of other 7 samples of three groups showed that 100% pancreatic cancer associated diabetes, 71% new-onset diabetes and 86% healthy controls were correctly classified. After searching protein database, there were metallothionein, pancreatic progenitor cell differentiation and proliferation factor-like protein, and fibroblastic growth factor 1, which were close to the weights of the above mentioned 3 differentially expressed proteins.ConclusionsSELDI can identify 3 biomarkers for pancreatic cancer associated diabetes and a reliable model for diagnosis of pancreatic cancer associated diabetes is established.

Diabetes mellitus; Pancreatic neoplasms; Proteomics; SELDI-TOF-MS

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2012.05.005

266003 青島，青島大學醫學院附屬醫院消化內科

田字彬，Email:tianzb@qdumh.qd.sd.cn

2012-05-23)

(本文編輯：呂芳萍)