一點紅提取物體外抗氧化活性研究

王 偉，張艷華，李超華，王立升，*，唐江濤，*

（1.廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004；2.廣西花紅藥業股份有限公司，廣西柳州545005）

一點紅提取物體外抗氧化活性研究

王 偉1，張艷華2，李超華2，王立升1，*，唐江濤1，*

（1.廣西大學化學化工學院，廣西南寧530004；2.廣西花紅藥業股份有限公司，廣西柳州545005）

目的：研究一點紅提取物體外抗氧化活性。方法：通過水提醇沉、有機溶劑萃取、大孔樹脂吸附純化，得到六種不同部位的樣品。以抗壞血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚為對照，測定樣品對羥基自由基和二苯基苦基苯肼自由基的清除能力，對Fe3+的還原能力，抑制油脂的氧化能力。結論：上述樣品均具有一定的抗氧化活性，其中大孔樹脂純化的50%乙醇洗脫部位活性最好，但總體上弱于抗壞血酸和2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚。

一點紅，抗氧化活性，大孔樹脂，二苯基苦基苯肼，羥基自由基，還原能力

一點紅[Emilia sonchifolia（Linn.）DC]是菊科一點紅屬一年生或多年生草本植物，是我國南方地區經常使用的傳統中草藥，又名羊蹄草、乳汁草、葉下紅、野苦草等。一點紅性味苦、涼，功能主治清熱解毒、散瘀消腫，可用于上呼吸道感染、肺炎、乳腺炎、腸炎、外傷感染、急性結膜炎、急性扁桃體炎、膽囊炎、傳染性肝炎、菌痢、尿路感染、濕疹、跌打損傷等[1]。研究表明，一點紅富含生物堿、黃酮類、三萜類、酚類等化學物質，特別是黃酮類物質可能與一點紅抗菌消炎功能有關[2-4]。本研究對一點紅進行提取分離，并首次追蹤其抗氧化活性部位，為找到一點紅抗氧化作用的活性成分建立基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

一點紅（干燥全草） 廣西花紅藥業股份有限公司；二苯基苦基苯肼（DPPH）、2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT） Sigma公司；石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、正丁醇、水楊酸、氫氧化鈉、雙氧水、硫代硫酸鈉、鹽酸、硫酸和碳酸鈉、硫酸亞鐵銨、抗壞血酸（VC）等 均為分析純；D101樹脂 滄州寶恩化工有限公司。

UV-T6型紫外-可見分光光度計 北京普析通用有限公司；RE-2000型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；SHB-Ⅲ循環式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；真空干燥箱 上海博訊實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 一點紅的提取分離

1.2.1.1 樣品Ⅰ的制備 采用水提醇沉法[5]。在10L圓底燒瓶中放入500g一點紅，加入約5000mL水，加熱回流2h，抽濾，保存濾液；再加入約4000mL水于圓底燒瓶中，回流2h，抽濾，合并濾液，濃縮，得黑色浸膏。在黑色浸膏中加入一定量65%乙醇溶液，超聲溶解，置于冰箱中過夜，第2d進行抽濾，濃縮，得到浸膏。將浸膏分成浸膏Ⅰ和浸膏Ⅱ，取浸膏Ⅰ，減壓濃縮，65℃下真空干燥，得水提醇沉部位，即樣品Ⅰ。

1.2.1.2 樣品Ⅱ的制備 將1.2.1.1中浸膏Ⅰ加入去離子水溶解，用石油醚脫脂數次，分取水層，用乙酸乙酯萃取至乙酸乙酯層為無色。對乙酸乙酯層減壓濃縮，65℃真空干燥，得乙酸乙酯提取部位，即樣品Ⅱ。

1.2.1.3 樣品Ⅲ的制備 取1.2.1.2中乙酸乙酯萃取后的水層，加入水飽和的正丁醇萃取，至正丁醇層為無色。對正丁醇層減壓濃縮，65℃真空干燥，得正丁醇提取部位，將所得正丁醇提取部位分為兩份，其中的一份即為樣品Ⅲ。

1.2.1.4 樣品Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ的制備 取1.2.1.3中一份正丁醇醇提取部位，用適量的去離子水溶解，選用D101大孔樹脂過柱。將上述水溶物過預先處理好的大孔樹脂柱進行吸附分離，依次用去離子水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇和無水乙醇進行洗脫，每次洗脫至洗脫液接近無色，分別收集洗脫液，減壓回收溶劑。由于70%乙醇、90%乙醇和無水乙醇洗脫得到量很少，因此取去離子水、30%乙醇和50%乙醇洗脫液減壓回收溶劑，置于真空干燥箱中65℃下干燥，得去離子水洗脫部位、30%乙醇洗脫部位和50%乙醇洗脫部位，即為樣品Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ。

1.2.2 體外抗氧化活性研究

1.2.2.1 樣品溶液與陽性參照溶液的配制 樣品溶液配制：精確稱取各樣品0.1g，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的樣品溶液，置于冰箱避光保存備用。抗壞血酸溶液配制：精確稱取0.1g抗壞血酸，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的陽性對照溶液，置于冰箱避光保存備用。BHT溶液配制：精確稱取10mg BHT，用60%乙醇溶解并定容于100mL容量瓶中，得1mg/mL的樣品溶液，置于冰箱避光保存備用。

1.2.2.2 對DPPH自由基清除能力的測定[6]DPPH溶液的配制：精確稱取10mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容于250mL的容量瓶中，得樣品溶液。對照品測定：吸取1mL 60%乙醇溶液和8mL DPPH溶液置于試管中，搖勻混合，避光放置，每隔10min于517nm波長下測定其吸光度Ac。樣品測定：分別吸取1mL樣品溶液和8mL DPPH溶液置于試管中，搖勻混合，避光放置，每隔10min于517nm波長下測定其吸光度Ai。

式中：Ac為1mL60%的乙醇加8mL DPPH溶液的吸光度；Ai為1mL各樣品溶液加8mL DPPH溶液的吸光度。清除率越高，樣品抗氧化能力越強。

同法以1mg/mL的抗壞血酸溶液和0.1mg/mL的BHT溶液進行DPPH自由基清除能力的測定。所有測定重復三次，取其平均值。

1.2.2.3 對羥基自由基清除能力的測定[7]利用Fenton反應H2O2和Fe2+混合產生·OH，在此體系內加入水楊酸，可以捕捉·OH并產生有色物質，該物質在510nm波長下有最大吸收峰。依次在每個25mL容量瓶中加入2mL各樣品溶液，2mL 9mmol/L FeSO4，2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇溶液，最后加入0.03%的H2O2溶液啟動反應。在37℃水浴條件下反應0.5h，以去離子水為對照，用60%乙醇定容，然后在510nm波長下測定各待測液的吸光度。考慮到樣品溶液本身在510nm波長下也有吸光值，因此，以2mL各樣品溶液，2mL 9mmol/L FeSO4，2mL 9mmol/L水楊酸-乙醇溶液為本底吸收，測量吸光值時定容。

式中：A0為空白對照液的吸光度；Ax為加入樣品溶液后的吸光度；Ax0為不加H2O2溶液本底的吸光度。

同法以1mg/mL的抗壞血酸溶液進行·OH自由基清除能力的測定。所有測定重復三次，取其平均值。

1.2.2.4 Fe3+還原能力的測定[8]取若干試管，移取1mL各樣品溶液，分別加入2.50mL pH6.6 0.2mol/L磷酸緩沖液和2.50mL 1%的K3Fe（CN）6溶液，搖勻混合。于50℃水浴條件下反應20min后，快速冷卻后加入2.50mL 10%的三氯乙酸溶液，搖勻后置于離心機中，以3000r/min離心10min，取上清液2.50mL，加入2.50mL去離子水和0.50mL 0.1%的FeCl3溶液，于700nm波長下測定吸光度值，吸光度越大，其還原能力就越強。所有測定重復三次，取其平均值。

1.2.2.5 對油脂氧化抑制作用的測定[9]精確稱取花生油8份，每份40g，置于250mL的燒杯中，分別移取10mL樣品溶液至不同燒杯中，不時攪拌成均相，置70℃恒溫干燥烘箱中，每隔24h取2.0g油樣移至錐形瓶中，測定油脂過氧化值（POV）。每次取樣后充分振搖燒杯，以混入足夠的空氣。POV測定方法參照GB/ T5538-1995的方法。

稱取2.0g試樣，加入到250mL錐形瓶中。在裝有試樣的錐形瓶中加入25mL氯仿-乙酸溶液（2∶3，v∶v）溶解試樣，并立即加入1mL碘化鉀飽和溶液，迅速蓋好瓶塞，混勻溶液1min，在25℃避光靜置5min。加入約75mL蒸餾水，以0.5%淀粉溶液作為指示劑，用硫代硫酸鈉標準溶液滴定析出的碘。滴定過程要用力振搖，滴定到藍色消失為止，記下體積V1，計算POV。POV計算公式為：

式中：POV為樣品過氧化值（meq/kg）；C為硫代硫酸鈉標準溶液的摩爾濃度（mol/L）；V1為樣品消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積（mL）；V2為空白實驗消耗硫代硫酸鈉標準溶液的體積（mL）；M為試樣質量（g）；0.1269為與1mL Na2S2O3標準滴定溶液相當的碘的質量（g）。

2 結果與分析

2.1 各樣品對DPPH自由基的清除作用

按1.2.2.2所述方法，得不同時間下，各樣品和BHT對DPPH自由基的清除作用，如圖1所示。

從圖1可知，一點紅提取部位樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、大孔樹脂分離部位Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和BHT對DPPH自由基均具有清除作用。隨著反應時間的增長，對DPPH自由基的清除率都增大。由圖1可以看出，樣品Ⅲ、Ⅳ和V對DPPH·的清除率都小于30%，而樣品Ⅰ、Ⅱ和Ⅵ的清除率效果較好，在20min前清除效果優于BHT，20min后BHT對DPPH·清除率增加趨勢變大，清除率超過各樣品。所測樣品中Ⅵ對DPPH自由基清除效果最好，Ⅱ次之，與DPPH·反應比BHT更加迅速靈敏。

圖1 各樣品及BHT對DPPH自由基的清除作用Fig.1 The DPPH free radical scavenging activity of samples and BHT

按1.2.2.2所述方法，按倍數稀釋樣品Ⅵ，測定其對DPPH自由基的清除率，不同濃度下的清除率如圖2所示。

圖2 50%乙醇洗脫部分對DPPH自由基的清除作用Fig.2 The DPPH free radical scavenging activity of 50% ethanol elution

從圖2可知，樣品Ⅵ對DPPH自由基的清除作用隨著反應時間的延長而變大。但因其濃度的不同，其清除效果差距比較大，并與濃度呈量效關系。濃度越高，清除效果越好。

2.2 各樣品對·OH的清除作用

按1.2.2.3所述方法，得不同濃度下樣品及VC對·OH的清除率，如圖3所示。

圖3 各樣品及VC對·OH清除率Fig.3 The·OH free radical scavenging activity of samples and BHT

從圖3可知，隨著各樣品濃度的增加，對·OH清除效果也隨之上升，其清除能力與濃度呈量效關系。當樣品處于低濃度時，樣品Ⅱ和Ⅵ相對于VC對·OH的清除效果更好；但在高濃度時，其清除效果低于VC。各樣品對·OH都具有一定的清除作用，其中樣品Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的清除作用較差；六種樣品中Ⅱ的清除效果最好。

2.3 各樣品對Fe3+還原能力的測定

按1.2.2.4所述方法，得不同濃度下各樣品的吸光值，吸光值越大，其還原能力越好，如圖4所示。

圖4 各樣品還原力的測定Fig.4 The reducing power of samples

從圖4可知，隨著各樣品濃度的增加，其吸光值A也增加。低濃度時，吸光值A增加趨勢較慢，低于高濃度時的增加速率。在1000μg/mg時，各樣品吸光值由大到小排列為：Ⅵgt;Ⅰgt;Ⅱgt;Ⅳgt;Ⅲgt;Ⅴ。吸光值與各樣品濃度呈量效關系，濃度越大，樣品吸光值就隨之變大，其還原能力就越強。

2.4 各樣品對油脂氧化的抑制作用

油脂放置在空氣中，容易被氧化產生自由基，而自由基又與空氣中的氧氣反應生成過氧化物，因此可以用油脂的POV來表示油脂的氧化程度。POV越大，其氧化程度就越高。按1.2.2.5所述方法得各樣品及BHT在不同天數的POV值，其結果如圖5所示。

圖5 各樣品及BHT對油脂氧化的抑制作用Fig.5 The inhibiting capacity of oil oxidation of samples and BHT

從圖5可知，空白組沒有加抗氧化劑，其POV從第1d到第12d一直是最大的。在第10d以前，各樣品的POV相差不大；從第10d開始，各樣品的POV出現較大差別，即空白組的POV快速增大，樣品Ⅴ的POV也迅速增大，表明Ⅴ對油脂氧化沒有抑制作用；樣品Ⅵ和BHT的POV都處于低位，第12d時，空白組POV為99.56meq/kg，而Ⅵ和BHT的POV值分別為25.23meq/kg和19.68meq/kg，表明樣品Ⅵ和BHT兩者具有較強的抗油脂氧化作用。

3 結論

對一點紅各提取部位以及D101大孔樹脂分離后的部位進行體外抗氧化測定，其測定項目包括DPPH自由基的清除能力、·OH清除能力、Fe3+還原能力以及抑制油脂氧化能力。結果表明，各樣品具有一定的清除DPPH自由基的能力，但均弱于BHT的清除能力，其中表現最好的是大孔樹脂的50%乙醇洗脫部位，其清除能力與樣品濃度呈量效關系。通過Fenton體系，測定各樣品·OH清除能力，各樣品都表現出對·OH具有一定的清除能力，樣品中50%乙醇洗脫部位對·OH的清除作用表現最好，但弱于VC的清除能力，其清除能力與樣品濃度呈量效關系。在Fe3+還原能力測定中，50%乙醇洗脫部位吸光值最大，其還原能力最強，還原力的大小與其濃度成正相關。此外，在抑制油脂氧化中，50%乙醇洗脫部位表現出較好抑制作用，僅稍弱于強抗氧化劑BHT。

實驗結果表明，在各項抗氧化測試中，50%乙醇洗脫部位表現最佳。因此可以推測，一點紅抗氧化有效成分存在于50%乙醇洗脫部位中，提示可對該部位進行深度研究，追蹤其抗氧化單體成分，為尋找高效的天然抗氧化劑提供實驗依據。

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Study on antioxidant activity of extracts of Emilia sonchifolia（Linn.）DC in vitro

WANG Wei1，ZHANG Yan-hua2，LI Chao-hua2，WANG Li-sheng1，*，TANG Jiang-tao1，*
（1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Guangxi University，Nanning 530004，China；2.Hua Hong Pharmaceutical Co.，Ltd.，Liuzhou 545005，China）

Objective：To study the antioxidant effects of extracts of Emilia sonchifolia（Linn.）DC.Methods：Get six different parts of the samples by water extraction and alcohol precipitation，organic solvent extraction，macroporous resin purification.Compared with the ascorbic acid and 2，6-di-t-butyl-4-methylphenol，these samples were tested for scavenging effects on the hydroxyl radical and the DPPH free radical，reducing ability and inhibiting capacity of oil oxidation.Conclusion：The results showed that the samples had antioxidant activities，the part of 50%ethanol elution showed the better activity than other samples，but weaker than the ascorbic acid and 2，6-di-t-butyl-4-methylphenol.

Emilia sonchifolia（Linn.）DC；antioxidant activity；macroporous resin；1，1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl；hydroxyl radical；reducing power

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0087-04

2011－05－16 *通訊聯系人

王偉（1986-），男，碩士，研究方向：生物有機。

廣西科技攻關項目（桂科攻09321054）。