梅片樹葉揮發油的抗氧化活性研究

陳建平，蘇健裕，陳 玲，李 琳，李 冰，李曉璽

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

梅片樹葉揮發油的抗氧化活性研究

陳建平，蘇健裕*，陳 玲，李 琳，李 冰，李曉璽

（華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州510640）

目的：對梅片樹葉揮發油的抗氧化活性進行了研究。 方法：采用水蒸氣蒸餾法提取得到揮發油，用紫外分光光度法測定揮發油對羥基（OH）自由基、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力以及揮發油的還原能力，并與2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）比較。同時，對影響其抗氧化活性的物質進行分析。 結果：揮發油對羥基自由基具有較好的清除能力，且清除效果要強于BHT；而揮發油對DPPH·的清除率和還原能力要明顯弱于BHT，梅片樹葉揮發油中高含量的總多酚和總黃酮可能是其抗氧化活性的主要物質來源。 結論：揮發油在某些抗氧化活性方面有較好的抗氧化效果，具有作為天然抗氧化劑的巨大潛力。

梅片樹，揮發油，抗氧化，水蒸氣蒸餾

梅片樹（Mei Pian tree）是樟科常綠喬木[1]，在外部形態方面與樟科樟屬的陰香（Cinnamomun burmannii B1.）無異，特點在于其葉含有豐富的右旋龍腦，故梅片樹應是陰香的一個含右旋龍腦的生理類型，或稱化學類型。梅片樹多數在南亞熱帶常綠闊葉林中或林緣混生[2]。在我國，梅片樹主要分部在云南及廣東東部地區。細胞內自由基產生的損傷可以導致癌癥、心血管疾病和免疫系統衰退等多種退變性疾病[3]，攝入外源性的抗氧化劑能有效地預防或抑制這些疾病的發生。因此，天然抗氧化劑受到越來越多的關注[4]。近年來，揮發油的抗氧化活性研究成為熱點，如迭迷香精油[5]、鼠尾草精油[6]、香菜精油[7]、仙人掌精油[8]等。上世紀八十年代，中科院華南植物所在廣東梅州地區的樟科陰香化學型——梅片樹枝葉中提取得到了揮發油。然而，目前國內梅片樹葉揮發油的研究主要集中在揮發油的提取工藝及其成分分析等方面，暫無對梅片樹枝葉中揮發油抗氧化活性的相關研究報道。本文運用水蒸氣蒸餾和抽濾得到梅片樹葉揮發油，通過紫外分光光度法對其清除羥基自由基和DPPH自由基的性能以及揮發油還原能力進行測定，并對影響其抗氧化活性的主要物質進行分析，從而探討梅片樹葉揮發油的抗氧化性能，以期為產業化開發梅片樹、闡明梅片樹揮發油抗氧化物質基礎和作用機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

梅片樹葉 廣東省梅州市廣東嘉應制藥股份有限公司提供，中科院華南植物研究所鑒定為樟科陰香化學型（Cinnamomun burmannii B1.）；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚 上海凌峰化學試劑有限公司，化學純；鐵氰化鉀、三氯乙酸 江蘇永華精細化學品有限公司，分析純；三氯化鐵 臺山市奧僑試劑塑料有限公司，分析純；30%過氧化氫 國藥集團化學試劑有限公司，分析純。

SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠；BS224S電子天平 德國Sartorius公司；50-conc紫外可見分光光度計 美國VARIAN公司；3K30冷凍高速離心機 美國SIGMR公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 揮發油的提取[9]將新鮮梅片樹葉粉碎，按《中國藥典》（2005版）附錄XD的水蒸氣蒸餾法提取揮發油。收集蒸餾的餾出物，向其中投入過量無水硫酸鈉并充分振蕩，使用循環水式真空泵抽濾此混合物得到揮發油。揮發油為黃色透明油狀物，稱量、計算揮發油的得率。

揮發油得率（%）=[揮發油質量（g）/梅片樹葉質量（g）]×100%

1.2.2 揮發油成分分析[10]

1.2.2.1 GC條件 HP-5MS彈性石英毛細柱管（30m× 0.25mm，0.25μm）；升溫程序：80℃恒溫1min后，以20℃/min的速度升溫至250℃，保持5min。進樣量0.5μL，采用不分流的方式進樣，進樣口溫度為250℃；檢測溫度為300℃；載氣為氮氣，過柱載氣恒流速為2mL/min。

1.2.2.2 MS條件 電子轟擊（EI）離子源；電子能量70eV；傳輸線溫度275℃；離子源溫度230℃；發射電流34.6VA，電子倍增器電壓1392V；掃描質量范圍m/z 33～450。

1.2.3 揮發油的抗氧化活性實驗

1.2.3.1 揮發油對羥基自由基清除能力的測定 取5支試管，依次加入1.5mmol/L的鄰二氮菲溶液1mL，磷酸鹽緩沖液PBS（pH7.4）2mL，揮發油各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，0.75mmol/L硫酸亞鐵溶液1mL，充分混勻，加入0.01%H2O21mL，在37℃下恒溫反應45min，在536nm處測其吸光度，其吸光值稱為As。同前步，用1mL蒸餾水代替H2O2，測得的吸光度稱為Ab。用蒸餾水1mL代替1mL溶液，測得的吸光度稱為Ap，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較。所有測定平行進行三次。OH自由基清除率計算公式如下：

1.2.3.2 揮發油對DPPH自由基清除作用的測定 取不同濃度的揮發油（0.02、0.1、0.2、0.5mg/mL）各2mL，分別添加0.2mmol/L的DPPH乙醇溶液各2mL，混合物用力振蕩并室溫避光反應30min，在517nm處測吸光值Ai，同時測定DPPH乙醇溶液2mL+乙醇2mL的吸光度Ao和溶液2mL+乙醇2mL的吸光度Aj，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作比較。所有測定平行進行三次。計算公式如下：

DPPH·抑制率（%）=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100%[15]

1.2.3.3 揮發油的還原能力測定 取不同濃度的揮發油溶液（0.2、0.4、1.0mg/mL）各2.5mL，加入0.2mol/L磷酸鈉緩沖溶液（pH=6.6）2.5mL和2.5mL的1%的鐵氰化鉀，混合物在50℃的水浴中保溫20min，再加入2.5mL的10%的三氯乙酸，在200×g下離心10min。取上清液3.5mL與0.5mL去離子水和0.5mL 0.1%的三氯化鐵混合，最后，在700nm處測其吸光度，用2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）做對照。所有測定平行進行三次。

1.2.3.4 揮發油中總黃酮含量的測定 采用Meda等[11]的方法，略有修改。取5mL揮發油，加入5mL 2%AlCl3溶液。另取揮發油5mL，加入5mL 2%乙醇溶液作為空白實驗，反應10min后在415nm處測定其吸光值。以蘆丁為標準品配成一定質量濃度的樣液做標準曲線，所有測定平行進行三次。所得蘆丁標準曲線方程如下：

式中：A：吸光度；C1：蘆丁的質量濃度（μg/mL）。

1.2.3.5 揮發油中總多酚含量的測定 采用Slinkard等[12]的方法，略有修改。取0.5mL的揮發油，依次加入1mL 0.2mol/L福林試劑、3mL 2%Na2CO3溶液和45mL蒸餾水，室溫振蕩反應2h，在760nm處測定其吸光度。以沒食子酸為標樣，配成一定質量濃度的樣液，繪制標準曲線，所有測定平行進行三次。根據測得的吸光度，計算樣品中的多酚含量（以沒食子酸計）。所得沒食子酸標準曲線方程如下：

式中：A：吸光度；C2：沒食子酸的質量濃度（μg/mL）。

2 結果與分析

2.1 揮發油的成分分析

采用水蒸氣蒸餾法提取梅片樹葉中揮發油，并且利用GC-MS分析揮發油的組成，其主要成分見表1。

表1 梅片樹葉揮發油的主要成分[10]Table 1 The main composition of volatile oil from Mei Pian tree

2.2 揮發油的抗氧化實驗結果

2.2.1 揮發油對羥基自由基的清除能力 鄰二氮菲-Fe2+是常用的氧化還原指示劑，其顏色變化可敏銳地反映溶液氧化還原狀態的改變。H2O2/Fe2+體系通過Fenton反應產生羥基自由基[13]，鄰二氮菲-Fe2+水溶液可被羥自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+，從而使鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰消失。當反應體系中存在羥基自由基清除劑時，就可以抑制羥基自由基的形成，從而使得鄰二氮菲-Fe2+在536nm處的最大吸收峰不會完全消失，根據536nm處吸光度的變化，可以推知樣品對羥基自由基的抑制率。

梅片樹葉揮發油和BHT對羥基自由基清除率的結果如表2所示，可知揮發油和BHT對羥基自由基都有一定的清除作用。在實驗測定的體積范圍內，揮發油和BHT對羥基自由基的清除率均隨著其體積的增加而增大，基本呈線性關系。從表2可知，在一定的體積范圍內（0.6～1.0mL），揮發油對羥基自由基的清除能力要強于BHT。當揮發油的體積為1mL時，對羥基自由基的清除能力達到最大（95.37%），遠大于1mL BHT對羥基自由基的清除能力（52.24%）。這可能是因為體積的增大，揮發油中抗氧化物質增多，對羥基自由基的清除能力增強。

表2 相同濃度不同體積的揮發油和BHT對羥基自由基的清除率Table 2 The different volume of the same concentration of volatile oil and BHT on activity of scavenging OH radicals

2.2.2 揮發油對DPPH·的清除能力 DPPH·在有機溶劑中由于苯環的共軛和位阻及硝基的吸電子作用而形成，是一種比較穩定的自由基[14]，其N上有一個游離電子，其乙醇溶液呈紫色，在517nm處有最大吸收峰。當有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數成定量關系[15]。依此原理用分光光度計檢測DPPH自由基與試樣液反應后吸光值的變化，可檢定樣品提供氫原子、清除自由基抗氧化的能力。

根據表3可知，揮發油和BHT對DPPH·的清除能力在不同濃度下強弱不同。在實驗測定的濃度范圍（0.02～0.5mg·mL-1）內，揮發油對DPPH·的清除能力要明顯弱于陽性對照BHT。隨著揮發油濃度的提高，其對DPPH·的抑制率總體呈上升趨勢。可能是由于揮發油濃度的提高，揮發油中抗氧化活性物質含量增多，從而使得揮發油對DPPH·的抑制率也有所上升。

表3 梅片樹葉揮發油對DPPH·的清除率Table 3 Scavenging effect on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl of essential oil from Mei Pian tree at different concentrations

2.2.3 揮發油的還原能力測定 三價鐵離子被樣品還原為二價鐵離子，二價鐵離子與鐵氰化鉀反應生成對可見光有較強吸收的普魯士藍[16]，通過測定普魯士藍的吸光度來間接判定樣品的還原能力。

不同濃度揮發油和陽性對照BHT的還原能力如表4所示，可知揮發油隨其濃度的上升，其還原能力也隨之增強。這也許是揮發油中具有還原能力的物質增加，使得更多的鐵離子還原成為亞鐵離子，因此吸光度值上升。當揮發油濃度為1.0mg·mL-1時，吸光度值為0.4492。從表4可知，相同濃度的揮發油的還原能力要明顯弱于BHT。

表4 不同濃度的揮發油和BHT的還原能力Table 4 The reductive ability of different concentration of volatile oil and BHT

2.2.4 揮發油中總黃酮和總多酚含量的測定 為了進一步探討梅片樹葉揮發油抗氧化活性的物質基礎，對揮發油中總黃酮和總多酚的含量進行了測定，其測定結果如表5所示。從表5可知，揮發油中總多酚和總黃酮的含量分別達到了（124.95±2.70）μg/mg和（2.7384±0.01）μg/mg，從而說明影響揮發油抗氧化活性的物質可能主要來自高含量的總多酚和總黃酮。江慎華[17]等人對丁香的抗氧化活性進行研究時，也發現其主要的抗氧化活性物質基礎由總多酚和總黃酮所貢獻。由此可見，梅片樹葉揮發油的抗氧化活性可能主要來自總多酚和總黃酮的假設得到了進一步的驗證。

表5 梅片樹葉揮發油中總黃酮和總多酚含量Table 5 Total phenolics and flavonoids content of essential oil from leaves of Mei Pian tree

3 結論

本實驗通過對羥基自由基的清除能力、DPPH·清除能力和揮發油還原能力三方面來評價梅片樹葉揮發油的抗氧化活性，并與陽性對照品BHT作比較。通過GC-MS分析影響揮發油的主要成分，并且測定了揮發油中總黃酮和總多酚的含量。實驗結果表明：在一定的體積范圍內，揮發油對羥基自由基清除能力要強于BHT，說明揮發油對羥基自由基具有較好的清除能力，能有效清除羥基自由基。盡管揮發油對DPPH·的清除率和還原能力均不如BHT，但考慮到揮發油是混合物，其中所含的雜質比較多，而陽性對照為高濃度的分析純，如果進一步提高揮發油中活性物質的濃度，其抗氧化效果將會有明顯的提高。經過GC-MS分析測定，揮發油的抗氧化活性由其主要成分決定，且揮發油中高含量的總多酚和總黃酮可能是其抗氧化活性的主要物質來源。

雖然上述實驗結果表明人工合成抗氧化劑BHT也具有良好的抗氧化效果，但作為化學合成抗氧化劑，其使用劑量有嚴格限制[18]。然而，相比化學合成抗氧化劑而言，天然的梅片樹葉揮發油具有毒副作用小、可使用劑量無嚴格限制等優點，且在某些抗氧化活性上也明顯優于人工合成的抗氧化劑，因此，梅片樹葉揮發油具有作為天然抗氧化劑的巨大潛力，這為開發新的天然無害抗氧化劑提供了新的思路和資源。同時，在食品保鮮、藥物研發等方面，梅片樹葉揮發油也具有相當廣闊的應用前景。

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Study on antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree

CHEN Jian-ping，SU Jian-yu*，CHEN Ling，LI Lin，LI Bing，LI Xiao-xi
（College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China）

The antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree（Cinnamomun burmannii physilogical type）was studied.The volatile oil was extracted by the methods of steam distillation.The antioxidant activity of volatile oil was evaluated by the methods of spectrophotometry，and the antioxidant activities were compared with BHT.The results showed that the activity of scavenging·OH radicals of volatile oil was stronger than BHT. The activity of scavenging DPPH·radicals and reduce power of volatile oil were weaker than BHT.And the antioxidant activity of volatile oil from Mei Pian tree mainly resulted from the high contents of total phenols and total flavonoids of volatile oil.Therefore，the volatile oil obtained from Mei Pian tree was proved to have strong antioxidant activity.

Mei Pian tree（Cinnamomun burmannii physilogical type）；volatile oil；antioxidant activity；steam distillation

TS201.2

A

1002-0306（2012）05-0149-04

2011－03－22 *通訊聯系人

陳建平（1986-），男，碩士研究生，研究方向：糖類物質及其藥物制備與生物利用。

廣東省自然科學基金博士啟動項目（10451064101005160）；廣東省教育部科技部企業科技特派員行動計劃專項項目（2009B090600055）；省部產學研結合項目（2009A090100041，2010B090500033）。