橘皮粗多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評(píng)價(jià)

董 航，陳瑞戰(zhàn)，李世哲，于 京，楊思敏，李 元

（長(zhǎng)春師范學(xué)院化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130032）

橘皮粗多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性評(píng)價(jià)

董 航，陳瑞戰(zhàn)*，李世哲，于 京，楊思敏，李 元

（長(zhǎng)春師范學(xué)院化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130032）

為了優(yōu)化橘皮粗多糖的微波提取工藝，評(píng)價(jià)橘皮粗多糖的抗氧化活性；通過(guò)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法（RSM）建立了微波提取時(shí)間（min）、料液比（g/mL）、微波功率（W）的二次回歸模型，對(duì)橘皮多糖的最佳微波提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化；并通過(guò)Fenton反應(yīng)和有機(jī)自由基（DPPH·）法對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化活性測(cè)試。實(shí)驗(yàn)表明，最佳提取條件為微波提取時(shí)間18min、料液比1∶25（g/mL）、微波功率250W，在該條件下橘皮粗多糖的提取得率為33.71%，高于傳統(tǒng)回流方法（15.75%）。橘皮粗多糖對(duì)·OH和DPPH·有顯著的清除作用，可以探索作為食品工業(yè)和制藥行業(yè)的天然抗氧化劑。

橘子皮，多糖，微波，工藝，抗氧化活性

橘皮，在我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥中又叫陳皮，系蕓香科植物橘樹(shù)的成熟果實(shí)之干燥果皮，味苦、辛，性溫，歸肺脾經(jīng)。桔子皮含有多糖及大量對(duì)人體有益的維生素B和C、香精油、芳香油、麝香草酚等有機(jī)物[1]。研究表明，植物多糖具有降血糖[2]、抗腫瘤[3]、抗氧化[4]等多種生理功能。多糖能夠參與細(xì)胞間的識(shí)別、機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)、細(xì)胞間物質(zhì)的運(yùn)輸、細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和凋亡等過(guò)程，不僅可以激活T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷（NK）細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞，而且可以活化補(bǔ)體系統(tǒng)，有效促進(jìn)IL-1、IL-2、IL-6、TNF等細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)[5]，且毒性低，因此在多種疾病的臨床應(yīng)用和功能食品等方面具有良好的前景[6]。多糖的提取方法很多，例如傳統(tǒng)的熱回流提取，雖然操作簡(jiǎn)單，但耗能多、耗時(shí)長(zhǎng)、提取效率低；超聲酶解提取利用超聲波和生物酶的雙重影響快速有效地提取多糖成分[7-8]；微波提取是在微波的高能磁場(chǎng)作用下，橘皮細(xì)胞內(nèi)的果膠、多糖等物質(zhì)被快速地提取。微波提取法選擇性強(qiáng)、操作時(shí)間短、溶劑用量小、受熱均勻、目標(biāo)組分得率高，是一種有效可行的方法[9]。目前對(duì)橘子皮多糖提取的研究，多集中在加熱浸提上，而關(guān)于直接微波提取工藝優(yōu)化條件的研究少有報(bào)道。本文利用響應(yīng)面法對(duì)橘皮粗多糖的微波提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，并進(jìn)行橘皮粗多糖的體外抗氧化活性評(píng)價(jià)，以期為天然抗氧化劑的篩選和橘皮多糖的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橘皮 市售橘子外皮；98%硫酸、苯酚、95%乙醇、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、30%過(guò)氧化氫、石油醚、葡萄糖等試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純，苯酚使用前經(jīng)蒸餾處理，收集180～182℃餾分待用；DPPH 德國(guó)Sigma-Aldrich Chemie GmbH公司；藏紅T 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-6恒溫水浴鍋，LD-4型離心機(jī) 金壇市科析儀器有限公司；RE-52CS-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海青浦滬西儀器廠；FA/JA電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；微波爐 青島海爾有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 市售橘皮自然晾干，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末。稱(chēng)取20g橘皮粉末，置于500mL圓底燒瓶中，加入石油醚，回流2h，脫去脂肪，抽濾，風(fēng)干，重復(fù)一次。

1.2.2 微波法單因素實(shí)驗(yàn) 對(duì)預(yù)處理后的橘皮，考察料液比、微波提取時(shí)間、微波功率三個(gè)因素對(duì)提取率的影響，在其他因素保持相同的條件下，選擇最優(yōu)的工藝條件。

取一定量橘皮粉，以水為提取溶劑，按不同的料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL）放入微波爐內(nèi)，在120～700W下提取12～28min，提取液離心，上清液減壓濃縮至一定體積后加入95%乙醇至乙醇最終濃度為60%（v/v），于室溫下醇沉24h，離心，沉淀溶于水后用蒸餾水透析（截留分子量3500u的半透膜）36h，除去小分子成分，凍干得橘皮粗多糖。

1.2.3 回流法提取橘子皮多糖 在料液比1∶35g/mL，提取溫度100℃，提取時(shí)間90min條件下，回流提取橘皮多糖[1]。提取液處理同1.2.2。

1.2.4 多糖含量的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用苯酚-硫酸比色法測(cè)多糖的得率。按照參考文獻(xiàn)[10]制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程A= 10.694C+0.0794，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，C是濃度（mg/mL），A為吸光值。

準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的粗多糖，加水溶解后定容成一定體積，用苯酚-硫酸法測(cè)定吸光值，代入回歸方程計(jì)算多糖含量，并按下式計(jì)算多糖的提取得率：

橘子皮多糖提取得率（%）=（橘子皮多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%

1.3 橘皮粗多糖的抗氧化活性評(píng)價(jià)

1.3.1 橘皮粗多糖對(duì)OH自由基的清除作用 根據(jù)宋茹[11]等人報(bào)道的方法，利用Fenton反應(yīng)檢測(cè)各種自由基清除劑對(duì)OH自由基的清除作用。·OH由EDTA Na2-Fe（Ⅱ）-H2O2體系產(chǎn)生，由于·OH可特異地使番紅花褪色，根據(jù)褪色程度用比色法來(lái)測(cè)定·OH的含量。反應(yīng)體系中加入pH為7.4的磷酸緩沖液1.0mL，番紅花（520μg/mL）0.2mL，EDTA Na2-Fe（Ⅱ）1.0mL，再加入不同濃度的樣品溶液1.0mL，最后加入6%的H2O20.8mL，混勻后于40℃水浴保溫30min，在波長(zhǎng)514.9nm處測(cè)吸光值A(chǔ)。每個(gè)多糖濃度作三個(gè)平行樣，取其平均值。空白組以等體積的重蒸水代替樣品溶液；對(duì)照組以等體積的重蒸水代替樣品溶液和EDTA Na2-Fe（Ⅱ）溶液。并與BHT對(duì)照比較。

式中：A0-空白組的吸光值，A1-多糖樣品的吸光值，A2-對(duì)照組的吸光值。

1.3.2 橘皮粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用 取不同濃度的粗多糖待測(cè)樣品溶液3.0mL，加入1.0mL 1.0×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液，立即混勻，在25℃條件下靜置0.5h后，用分光光度計(jì)于517nm處測(cè)定吸光度Ai。則多糖對(duì)DPPH·的清除率（%）可表示為：

式中：Ai為DPPH·與樣液反應(yīng)后的吸光度，Aj為樣品空白（樣品3.0mL+1.0mL甲醇）的吸光度，Ac為未加樣的DPPH·（1.0mL 1.0×10-4mol/L DPPH·甲醇溶液+3.0mL水）的吸光度，每一樣品平行測(cè)三次，取其平均值，并與BHT對(duì)照比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波輻射時(shí)間對(duì)提取得率的影響 固定料液比為1∶10g/mL，微波功率為250W，考察提取時(shí)間（12、16、20、24、28min）對(duì)橘皮多糖提取得率的影響（見(jiàn)圖1）。由圖1可知，在12～16min的時(shí)間范圍內(nèi)，隨著輻射時(shí)間的延長(zhǎng)，粗多糖提取得率快速增加，當(dāng)輻射時(shí)間超過(guò)20min時(shí)，再增加輻射時(shí)間，可能會(huì)對(duì)產(chǎn)物本身結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，提取率反而減小，因此適宜輻射時(shí)間為20min。

圖1 微波輔助時(shí)間對(duì)橘皮多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave assisted time on the extraction rate of polysaccharide from orange peel

2.1.2 料液比對(duì)橘皮多糖提取得率的影響 固定微波輻射時(shí)間為20min，微波功率為250W，考察料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50g/mL）對(duì)橘皮多糖提取得率的影響（見(jiàn)圖2）。由圖2可知，隨著料液比的增大，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)料液比為1∶30g/mL時(shí)最大，再增加料液比，提取率反而減小。因?yàn)椋⒉ǚㄌ崛∈强课⒉ù┩钙鞅趯⑽锪险w加熱并打破細(xì)胞壁使得其中有效成分流出，提取液過(guò)多會(huì)遲緩加熱的過(guò)程，提取率降低，從有效利用資源和降低能耗兩方面考慮，最適宜料液比為1∶30g/mL。

圖2 料液比對(duì)橘皮多糖提取率的影響Fig.2 Effect of solid to liquid ratio on the extraction rate of polysaccharide from orange peel

2.1.3 微波功率對(duì)橘皮多糖提取率的影響 固定微波輻射時(shí)間為20min，料液比為1∶30g/mL，考察微波功率（120、250、450、600、700W）對(duì)橘皮多糖提取得率的影響（見(jiàn)圖3）。由圖3可知，隨著微波功率的增大，多糖提取率也逐漸增加，當(dāng)微波功率為250W時(shí)最大，再增加微波功率提取率反而減小，其原因可能是由于微波功率的增大，使橘皮的組織細(xì)胞遭到破裂，系統(tǒng)的溫度升得很高，引起溶劑的劇烈沸騰，不僅造成溶劑的大量損失，而且還會(huì)帶走已溶解入溶劑中的部分溶質(zhì)，影響提取率。同時(shí)微波功率的增大，也有可能造成橘子皮多糖化學(xué)結(jié)構(gòu)的變化，從而使多糖提取量下降。因此最適宜微波功率為250W。

圖3 微波功率對(duì)橘皮多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on the extraction rate of polysaccharide from orange peel

2.2 響應(yīng)面分析與結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，綜合提取橘皮多糖的最佳條件的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2.2.1 響應(yīng)面分析 采用Box-Behnken按表1響應(yīng)面分析因素及水平表設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，共15組。每個(gè)自變量的低中高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，以橘皮多糖提取率為響應(yīng)值（Y）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，參照1.2.2進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案及橘皮多糖得率的測(cè)定值Table 2 Box-Behnken experimental design and result

2.2.2 多元二次響應(yīng)面回歸模型的建立與分析 采用Design-Expert軟件對(duì)表2的提取量和影響因素進(jìn)行多元回歸分析和最小二乘法擬合，得對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸模擬方程：y=20.45-4.02x1-3.57x2+ 0.77x3+3.62x1x2-1.13x1x3-6.55x2x3+1.28x12+4.04x22-6.54x32。該方程表達(dá)了橘皮多糖的提取率與微波各提取因素之間的變化規(guī)律。

其中，Y是效應(yīng)值，即橘皮多糖的提取率，X1、X2和X3是自變量，即微波輻射時(shí)間、料液比和微波功率三個(gè)考察因素，因素的方差分析見(jiàn)表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

由表3可知，響應(yīng)面模型達(dá)到了較顯著的水平，模型的R2值為0.8962，說(shuō)明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好。模型中的一次項(xiàng)X1和二次項(xiàng)中的X32影響達(dá)到較顯著水平（P＜0.05）；交互項(xiàng)X2X3影響達(dá)到較顯著水平（P＜0.05）。由響應(yīng)面模型得到最佳提取條件：-1，-1，+0.65，即微波輻射時(shí)間18min、料液比1∶25g/mL、微波功率380W，得到理論值為39.7013%。根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件調(diào)整為：微波輻射時(shí)間18min、料液比1∶25g/mL、微波功率450W，經(jīng)驗(yàn)證其多糖提取率為30.47%，與響應(yīng)面結(jié)果相比，實(shí)驗(yàn)號(hào)9的提取率更接近于理論值，綜上，選取實(shí)驗(yàn)號(hào)9的工藝條件為最終提取條件。

圖4 料液比和微波功率相互作用對(duì)橘皮多糖提取率的響應(yīng)面Fig.4 Response surface of ratio of solid to liquid and ultrasonic power on the extraction rate of polysaccharides

2.2.3 雙因子間交互影響分析 由表3可知，所建立的模型中只有X2X3的相互作用達(dá)到較顯著水平，即料液比和微波功率的相互作用對(duì)橘皮多糖的提取率有較顯著影響（P＜0.05），其作用如圖4所示。由圖4可知，隨著料液比的增加，多糖提取率呈上升趨勢(shì)，但趨勢(shì)較小，說(shuō)明料液比對(duì)橘皮多糖的提取率影響不顯著。隨著微波功率的增加，多糖提取率呈先上升趨勢(shì)后趨于平穩(wěn)。微波功率的增加，使體系的溫度升高，加快了多糖的溶出速度，使多糖提取率逐漸上升。在較低料液比下，適當(dāng)增加微波功率有利于多糖提取率的升高。

2.3 不同方法提取橘皮多糖的抗氧化活性的比較

2.3.1 橘皮多糖對(duì)·OH清除作用 由圖5得知，在4～9.5mg/mL的有效濃度范圍內(nèi)，隨著橘皮多糖濃度的增加，清除·OH的作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)多糖濃度為9.5mg/mL時(shí)，微波提取的橘皮多糖對(duì)·OH的清除率達(dá)到60.89%，遠(yuǎn)高于回流提取的橘皮多糖（42.49%），因此橘皮多糖具有一定的清除·OH的能力。但與BHT相比清除能力較弱，當(dāng)濃度為5mg/mL時(shí)，BHT對(duì)·OH的清除率達(dá)到77.76%，而微波提取的橘皮多糖對(duì)·OH的清除率達(dá)到34.76%。

圖5 橘皮多糖對(duì)·OH的清除影響Fig.5 Effect of orange peel polysaccharides on·OH removal

2.3.2 橘皮多糖對(duì)DPPH·的清除作用 由圖6可知，在0.5～4mg/mL的有效濃度范圍內(nèi)，隨著橘皮多糖濃度的增加，清除DPPH·的作用逐漸增強(qiáng)。清除率與多糖濃度呈一定的量效關(guān)系。當(dāng)多糖濃度為4.0mg/mL時(shí)，微波提取的橘皮多糖對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到75.61%，高于回流提取的橘皮多糖（45.48%），也高于BHT（71.77%）。因此橘皮多糖體外有顯著的清除DPPH·的作用。

圖6 橘皮多糖對(duì)DPPH的清除影響Fig.6 Effect of orange peel polysaccharides on DPPH removal

3 結(jié)論

3.1 采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)及響應(yīng)面法（RSM）建立了微波輻射時(shí)間、料液比、微波功率的數(shù)學(xué)模型，確定最佳工藝條件為：微波輻射時(shí)間18min、料液比1∶25g/mL、微波功率250W，在該條件下橘子皮粗多糖的提取得率為33.71%，高于傳統(tǒng)回流方法（15.75%）。表明微波法可以顯著提高橘皮多糖的提取率。

3.2 與傳統(tǒng)的回流提取工藝相比，微波提取具有提取省時(shí)、節(jié)能、抗氧化活性好等優(yōu)點(diǎn)。

3.3 橘皮粗多糖能有效清除·OH和DPPH·，可以探索將其作為食品工業(yè)和制藥行業(yè)的天然抗氧化劑。

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Optimization of extraction technology of orange peel crude polysaccharides and evaluation of its antioxidant activity

DONG Hang，CHEN Rui-zhan*，LI Shi-zhe，YU Jing，YANG Si-min，LI Yuan
（College of Chemistry，Changchun Normal University，Changchun 130032，China）

The response surface methodology was employed to study microwave extraction（ME）crude polysaccharide from orange peel，and the antioxidant activities of crude orange peel polysaccharide（OPP）was evaluated.The best possible combination of extraction parameters was obtained with the response surface methodology（RSM），at a three-variable，three-level experiment Box-Behnken design（BBD）.The antioxidant activities of OPP was evaluate on the basis of Fenton reaction and 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH·）free radical scavenging assay in vitro.The optimum extraction parameters were as follows：extracting time 18min，the ratio of solid to liquid 1∶25（g/mL），microwave power 250W.Under these conditions，the extraction yield of crude polysaccharide with ME was 33.71%，higher than that of classical refluxing extraction（15.75%）. Furthermore，the antioxidant activities of OPP was evaluated on the basis of hydroxyl（·OH）and 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl（DPPH·）free radical scavenging assay，respectively.The results showed that the OPP possessing pronounced·OH and DPPH· free radical scavenging activity，might explore as a potential antioxidant in food industry and pharmaceuticals.In comparison with classical refluxing extraction，the ME showed obvious advantages in shorter extraction times，higher extraction yield，at lower energy costs，higher antioxidant activity and so on.

orange peel；polysaccharides；microwave；technology；antioxidant activity

TS201.2

B

1002-0306（2012）05-0215-05

2011－05－25 *通訊聯(lián)系人

董航（1987-），女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物分析。

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2010105）；吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究重大項(xiàng)目（吉教科合字[2011]第185號(hào)）。