響應面法優化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究

曹 川，包建強

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

響應面法優化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究

曹 川，包建強*

（上海海洋大學食品學院，上海201306）

研究微波對中性蛋白酶水解貽貝蛋白條件的影響，探討了在一定的微波功率/時間，加酶量、酶解溫度和時間對蛋白質回收率的影響。單因素實驗先確定因素水平，再通過響應面確定最佳的工藝條件，酶解條件分別是時間為118.8min，加酶量為0.754%，微波功率為189.7W，溫度分別為46.9℃，該條件下得到的最大蛋白質回收率為74.83%。

微波，酶法水解，貽貝

貽貝，俗稱“海紅”、“淡菜”等，是一種優質的海產養殖貝類，越來越受到公眾的重視[1]。貽貝不僅具有很高的食用價值，還富含蛋白質，多聚不飽和脂肪酸、礦物質、維生素等營養物質，同時還具有抗疲勞、抗腫瘤、增強免疫力等保健功能[2]。微波技術最大的特點是縮短提取時間，提高效率，節約成本[3-4]。本實驗利用微波輔助中性蛋白酶[5-6]水解貽貝蛋白，有提高蛋白質回收率、酶用量少等特點，可為貽貝蛋白資源的利用提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮貽貝 產自嵊泗貽貝養殖基地；風味蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；中性蛋白酶、福林試劑、三氯乙酸、甲醛等 均為分析純，購于國藥試劑有限公司。

NN-GD567M微波爐 上海松下微波爐有限公司；Kjeltel2300凱氏定氮儀 丹麥FOSS儀器有限公司；SZF06全自動粗脂肪測定儀 浙江托普儀器有限公司；ETO DENKI THERMIC MODEL 2100A熱電偶測溫儀，METTLER TOLEDO FIVEEASY酸度計等。

1.2 實驗方法

1.2.1 制備提取液 稱取5份50g經前處理的貽貝于燒瓶中，加150mL蒸餾水，加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH（pH6.5），分別在不同微波功率及輻射時間組合條件下水解，利用熱電偶測溫儀監測，當酶解溫度達到45℃，停止微波，取出后繼續在45℃水浴下水解120min，經滅酶（95℃、10min），離心（9000r/min、20min）得上清液為貽貝蛋白水解產物，測定蛋白質回收率。

1.2.2 蛋白質回收率的測定[5]用凱氏定氮法分別測定上清液和酶解液中蛋白氮含量，并按下式計算：蛋白質回收率（%）=（上清液總蛋白氮量/原料總蛋白氮量）×100%

1.2.3 響應曲面設計 在單因素實驗結果基礎上，綜合考慮4個因素對蛋白質回收率的影響，采用Box-Behnken設計方案做響應曲面研究，建立了貽貝蛋白提取率的二次多項式數學模型。4個自變量：酶解時間、加酶量、溫度、微波功率分別以A、B、C、D代表，如表1所示。

表1 實驗因素和水平表Table 1 Experimental factors and level table

2 結果與分析

2.1 單因素實驗對蛋白質回收率的影響

2.1.1 微波功率對蛋白質回收率的影響 分別稱取50g經前處理的貽貝于燒瓶中，加150mL蒸餾水，加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH，分別在不同微波功率及輻射時間組合條件下水解，取出后繼續在45℃下水解120min，經滅酶、過濾后，將濾液濃縮，測定蛋白質回收率。由圖1可知，在微波功率從100W到200W時，蛋白質回收率是呈增加的趨勢，當200W到300W蛋白質回收率呈下降趨勢，在200/41（W/s）時達到最大值，因此認為微波功率為200W，對應的微波加熱時間為41s時為最佳的實驗條件。

圖1 微波功率對蛋白質回收率的影響Fig.1 Effect of microwave power on the protein recovery rate

圖2 酶用量對蛋白質回收率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on the protein recovery rate

2.1.2 酶用量對蛋白質回收率的影響 分別稱取50g經前處理的貽貝于燒瓶中，加150mL蒸餾水，分別按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%的比例加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH，在200W/41s微波功率及輻射時間組合條件下水解，取出后繼續在45℃下水解120min，經滅酶、過濾后，將濾液濃縮，測定蛋白質回收率，結果如圖2所示。從圖2可以看出，隨著加酶量的增加蛋白質回收率也是遞增的，從0.20%到0.60%時增加迅速，從0.60%到1%是緩慢增加，加酶量的增加導致成本的增加，綜合經濟因素，0.60%是最佳的加酶量。

2.1.3 料液比對蛋白質回收率的影響 以1∶2、1∶2.5、1∶3、1∶3.5、1∶4的料液比，分別按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH，在200W/41s微波功率及輻射時間組合條件下水解，取出后繼續在45℃下水解120min，過濾后，將濾液濃縮，測定蛋白質回收率，結果如圖3所示。從圖3可以看出，1∶2到1∶3是呈增加的趨勢，1∶3到1∶4是呈下降趨勢。1∶3是最佳的料液比，因為隨著料液比的增大，酶活力不斷增大達到最大值后就不變，因此蛋白質的回收率趨勢是先上升再下降。

圖3 料液比對蛋白質回收率的影響Fig.3 Effect of concentration on the protein recovery rate

2.1.4 水解溫度對蛋白質回收率的影響 分別稱取50g經前處理的貽貝于燒瓶中，加150mL蒸餾水，分別按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH，在200W/41s微波功率及輻射時間組合條件下水解，取出后分別在35、40、45、50、55℃水解120min，經滅酶、過濾后，將濾液濃縮，測定蛋白質回收率，結果如圖4所示。從圖4可以看出，35～45℃是呈增加的趨勢，45～55℃呈下降的趨勢，45℃時蛋白質的回收率達到最大值，45℃是最佳的酶解條件。酶活力在低溫時被抑制，在高溫時被破壞，在最適溫度下酶活力達到最大。

圖4 水解溫度對蛋白質回收率的影響Fig.4 Effect of temperature on the protein recovery rate

2.1.5 水解時間對蛋白質回收率的影響 分別稱取50g經前處理的貽貝于燒瓶中，加150mL蒸餾水，分別按照0.80%的比例加入中性蛋白酶混合均勻，調節pH，在200W/41s微波功率及輻射時間組合條件下水解，取出后分別在45℃水解60、120、180、240、300min，經滅酶、過濾后，將濾液濃縮，測定蛋白質回收率，結果如圖5所示。由圖5可以看出，隨著時間的增加，蛋白質回收率遞增，但是隨著時間的增加，水解液的風味變化明顯，會出現腥臭味，60～120min時增加迅速，120～300min時增長緩慢。所以認為120min時為最佳水解時間。

圖5 水解時間對蛋白質回收率的影響Fig.5 Effect of time on the protein recovery rate

2.2 響應曲面優化實驗

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗 在不同微波功率及輻射時間組合條件下水解，利用熱電偶測溫儀監測，當酶解溫度達到45℃，停止微波，因此不同微波對應時間固定，100W/83s、150W/64s、200W/41s、250W/30s、300W/22s。利用Design Expert 7.0程序對實驗進行處理分析，回歸方程的方差分析、各項的方差分析和參數估計及顯著性分析的主要結果歸納分別見表3。 53017.98AB+6414.19AC+1433.25AD+13485.48BC+ 6758.13BD+29.71CD-1.851A2-1.318B2-2263.41C2-41.82D2

表2 響應面分析實驗結果Table 2 Result of response

利用Design Expert 7.0軟件對數據進行二次多元回歸擬合微波輔助酶解貽貝蛋白方程：

Y=-26.47+2329.05A+3659.68B+834.94C-3.79D-

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

二次回歸模型的F值12.14，P值＜0.0001，大于在0.01水平上的F值，而缺失項的F值為3.81，小于在0.05水平的F值，說明該模型擬和結果好，一次項、二次項和交互項的F值均大于0.01水平上的F值，說明各個因素之間的交互作用都對回收率有極其顯著的影響。利用SAS軟件進行分析，蛋白質回收率最高時的條件是時間、加酶量、溫度和微波功率分別為118.8min、0.754%、46.9℃、189.7W，該條件下得到的最大蛋白質回收率為74.83%。

2.2.2 響應面分析 利用Design Expert 7.0軟件對表2數據進行二次多元回歸擬合，所得到的二次回歸方程的響應曲面見圖6～圖11。

由圖6可知，B（加酶量）不變的條件下，固定A提取時間，曲線呈現先增高后降低的較陡的曲線，由圖7可知，在C（溫度）不變的條件下，固定A（提取時間），曲線呈先增加后遞減的規律。由圖6、圖7、圖9響應面圖形可知，等高線都為橢圓形，說明時間和加酶量、時間和溫度以及溫度和加酶量兩兩之間的交互作用明顯，都對蛋白質的回收率有影響。

圖6 時間和加酶量對蛋白質回收率的影響Fig.6 Effect of temperature and enzyme concentration on the protein recovery rate

圖7 溫度和時間對蛋白質回收率的影響Fig.7 Effect of temperature and time on the protein recovery rate

圖8 微波功率和時間對蛋白質回收率的影響Fig.8 Effect of microwave power and time on the protein recovery rate

圖9 溫度和加酶量對蛋白質回收率的影響Fig.9 Effect of temperature and enzyme concentration on the protein recovery rate

圖10 微波功率和加酶量對蛋白質回收率的影響Fig.10 Effect of microwave power and enzyme concentration on the protein recovery rate

圖11 微波功率和溫度對蛋白質回收率的影響Fig.11 Effect of microwave power and temperature on the protein recovery rate

由圖8可知，在D（微波功率）固定的條件下，A（提取時間）不變的情況下，貽貝蛋白的回收率曲線呈現先陡峭增加后平滑遞減的規律，說明在開始時微波功率的增大對蛋白質回收率的影響較大。由圖8、圖10、圖11可知，貽貝蛋白的回收率是先增加后降低，等高線的形狀反映出微波功率與酶解時間、加酶量、溫度之間的交互作用的較弱，響應面比較陡峭說明蛋白質回收率對時間、加酶量、溫度、微波功率的變化敏感[7-9]。

2.3 模型驗證

為檢驗響應曲面法的可靠性，采用上述優化條件進行實驗，對實驗結果進行驗證。考慮到實際操作的便利，將酶解工藝參數進行修正：時間為119min，加酶量為0.75%，微波功率為190W，溫度為47℃。該條件下得到的最大蛋白質回收率為74.53%、74.15%、74.29%、74.65%、74.47%，平均值為74.418%，偏差不大，證明該結果是合理可靠的。

3 結論

蛋白質回收率與4個關鍵因子（酶解時間、加酶量、溫度、微波功率）的二次多項回歸模型，經過驗證是合理可靠的，同時利用響應面對關鍵因子及其相互作用進行了分析，得出最佳酶解條件分別是：時間為118.8min、加酶量為0.754%、微波功率為189.7W、溫度為46.9℃，該條件下得到的最大蛋白質回收率為74.83%左右。該研究可以為有效科學地酶解貽貝蛋白提供重要的技術基礎。

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Study on optimization of microwave-assisted hydrolization of mussels using response surface methodology

CAO Chuan，BAO Jian-qiang*
（Shanghai Ocean University，College of Food Science，Shanghai 201306，China）

The impact of microwave extraction technique on neutrase hydrolyzing mussel was investigated. Under certain conditions of microwave power/radiation time，enzyme concentration，enzyme temperature and time influence recovery of hydrolysis has been discussed.The best extraction process conditions were determined by preferable level of factor which was decided by univariate test as well as response surface methodology.The results showed that the best conditions of enzyme hydolyzing mussel were：time was 118.8min，neutrase concentration was 0.754%，microwave power was 189.7W，temperature was 46.9℃，the hydrolization rate could reach 74.83%.

microwave；enzyme hydrolization；mussel

TS254.1

B

1002-0306（2012）05-0258-04

2011－05－31 *通訊聯系人

曹川（1988－），女，碩士研究生，研究方向：食品冷凍。

上海市教育委員會重點學科建設項目（J50704）。