卷心菜中葉黃素提取工藝研究

謝 翎，陳紅梅，楊吉彬，黃 勃

（1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶246011；2.安徽農業大學微生物防治省重點實驗室，安徽合肥230036；3.安慶龍麟農業生態博覽園發展有限公司，安徽安慶246003）

卷心菜中葉黃素提取工藝研究

謝 翎1，2，陳紅梅1，楊吉彬3，黃 勃2，*

（1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶246011；2.安徽農業大學微生物防治省重點實驗室，安徽合肥230036；3.安慶龍麟農業生態博覽園發展有限公司，安徽安慶246003）

采用超聲波輔助提取卷心菜中的葉黃素，高效液相色譜法檢測葉黃素含量。在單因素實驗的基礎，通過正交實驗確定卷心菜中葉黃素的最優工藝條件為：丙酮為提取劑，超聲波功率為500W，超聲提取時間為30min，料液比為1∶30，提取溫度為60℃。卷心菜干粉中葉黃素含量約為5.6mg/100g。研究結果對葉黃素的生產與商業化應用將具有重要意義。

卷心菜，高效液相色譜法，葉黃素，超聲波

圖1 全反式異構體葉黃素分子結構圖Fig.1 The structure of trans isomer lutein

葉黃素（lutein）是一種天然色素，又稱植物黃體素，屬于“類胡蘿卜素”類物質，最早是由Wihelm與Wackenroder兩位科學家于1831年發現的[1]。葉黃素分子量為568.9，其分子碳架，主要由兩個六元環和一個多聚烯鏈共同組成。雖然，在理論上葉黃素有多種同分異構體，但自然條件下葉黃素主要還是以全反式異構體的形式存在[2]（圖1）。由于具有色澤鮮艷、著色力強、安全無毒、富含營養等特點，葉黃素越來越受到人們的重視，從而在食品、保健品及醫藥領域被廣泛的應用。隨著對葉黃素相關研究的不斷深入，人們發現葉黃素其實是一種優良的抗氧化劑[3]，在預防年齡相關性視黃斑退化[4-5]，降低結腸癌發病率[6]，預防心血管疾病的發生等方面有著顯著的效果。目前，國際上對葉黃素的需求量日益增大，價格不斷提升。因此，研究開發新的具有潛力的葉黃素植物源具有重要的商業價值。卷心菜（Brassica oleracea L.var. capitata L.），又名球甘藍，屬于甘藍的變種，我國各地都有栽培。卷心菜口味清香，脆嫩，四季都能吃到，是主要的蔬菜品種之一。近年，西方一些國家的學者們發現它在抗衰老和防止心腦血管疾病、癌癥等方面顯現了奇異功效[7]。卷心菜在我國的產量非常高，且價格較低。通過卷心菜來提取葉黃素是一種非常理想的選擇。本研究就是在前人工作的基礎上，探索和優化卷心菜葉黃素提取工藝。由于常規葉黃素提取都是通過皂化方法，工藝較為復雜；本文采用超聲波輔助有機溶劑提取卷心菜中葉黃素，旨在獲得卷心菜中葉黃素的高效能提取法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心菜 購于本地農貿市場，葉片洗凈后切碎，經24h凍干后粉碎，卷心菜干粉用于后續葉黃素提取（卷心菜干粉可過50目篩）；葉黃素標樣 德國Sigma公司；丙酮、二氯甲烷、乙酸乙酯、氯仿 均為國產分析純；甲醇 國產色譜純。

Waters600高效液相色譜儀、分析型色譜柱（5μm，4.6×250mm，ODS2） 美國Waters公司；FreeZone12冷凍干燥系統 美國Labconco公司；SENCO R-502旋轉蒸發儀 上海申勝生物技術公司；KH5200DB超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取液的確定 由于葉黃素易溶于二氯化碳、氯仿以及酯類。因此選取二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯，以及常用有機試劑丙酮作為候選萃取液，以篩選合理的葉黃素提取溶劑。

精確稱量5.0g卷心菜干粉，分別用二氯化碳、氯仿、乙酸乙酯以及丙酮定容至100mL，在超聲波清洗器中400W功率下振蕩60min（振動處理溫度50℃）。振蕩結束后，對樣品在5000×g下離心5min。將澄清提取液旋轉蒸干后，統一用丙酮定容至10mL。樣品再次在5000×g下離心5min，進HPLC檢測。另外，用丙酮分別配制葉黃素標準樣品溶液5、10、20、50、100μg/mL。

1.2.2 超聲波振動功率的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，分別在200、300、400、500、600W功率的超聲波下振動60min（振動處理溫度50℃）。振蕩結束后，對樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進HPLC檢測。

1.2.3 超聲波振動時間的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用丙酮定容至100mL，50℃下分別在超聲波500W下振動10、30、60、90、120min（振動處理溫度50℃）。振蕩結束后，對樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進HPLC檢測。

1.2.4 料液比的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，分別用25、50、100、150、200mL丙酮定容，50℃下在超聲波500W下振動30min（振動處理溫度50℃）。振蕩結束后，對樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進HPLC檢測。

1.2.5 超聲波處理溫度的確定 稱取卷心菜干粉5.0g，用150mL丙酮定容，分別于40、50、60、70℃用超聲波500W功率振動30min。振蕩結束后，對樣品離心。將澄清提取液濃縮后，用丙酮定容至10mL。樣品再次離心后，進HPLC檢測。

1.2.6 液相色譜條件 Waters高效液相色譜儀，檢測波長446nm，色譜柱ODS2反向C18柱，柱溫25℃，色譜時間20min，平衡時間5min，流動相為純甲醇（流速0.5mL/min），進樣量20μL。所有樣品檢測處理，均重復三次。

1.2.7 統計學處理 HPLC峰面積表達結果為平均值±標準差，使用DUCAN多重比較法[8]進行多個均數間兩兩比較。數據分析均使用DPS數據處理系統軟件[9]。

1.2.8 正交實驗設計 在單因素實驗基礎上，繼續選擇超聲波處理功率、處理時間、處理溫度及料液比為考察因素，以葉黃素HPLC檢測出峰面積為指標，采用L9（34）正交實驗（見表1），優化出卷心菜中葉黃素提取的最佳工藝參數。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal design

2 結果與討論

2.1 標準曲線的建立

通過葉黃素標樣進HPLC所得峰面積，在濃度5～100μg/mL范圍內，以葉黃素濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，得到回歸方程：y=548.4x+711.76，R2=0.9992。通過各處理樣品與標樣出峰時間對比，可以確定在4min左右所出峰為同一物質，即葉黃素。將各樣品峰面積代入上述回歸方程，即可獲得卷心菜干粉中葉黃素含量。

2.2 單因素實驗

2.2.1 提取試劑的確定 從表2可以看出，用丙酮作為提取溶劑提取的葉黃素量最多，其次為二氯甲烷和氯仿，乙酸乙酯提取量最低，且差異極顯著。

表2 不同溶劑處理對卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 2 Effect of solvents on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.2 超聲波振動功率的確定 選擇丙酮作為提取溶劑，在不同的超聲波功率處理下振蕩60min。從表3可以看出，隨著超聲波振動功率的上升，在60min內葉黃素的出峰面積呈現明顯的波動。200W時，葉黃素的出峰面積最小，只有7537.48mAU。當超聲功率升到500W，峰面積達到最大值，為13573mAU。當超聲波功率超過500W繼續上升時，葉黃素的出峰面積開始降低。方差分析表明，各處理出峰面積差異極顯著。

2.2.3 超聲波振動時間的確定 選擇丙酮作為提取溶劑，在500W超聲波功率處理下振蕩不同時間。從表4可以看出，超聲處理30min時，葉黃素的出峰面積保持在最大值13536mAU。方差分析表明，超聲處理30min與60min峰面積差異不明顯。另外，當超聲處理超過60min后，葉黃素的出峰面積明顯開始下降。當振蕩2h后，葉黃素的出峰面積下降至12182mAU。

表3 不同功率的超聲振蕩對卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 3 Effect of ultrasonic power on extraction yield of lutein from cabbage

表4 不同時間超聲處理對卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 4 Effect of ultrasonic treatment time on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.4 料液比的確定 選擇不同體積的丙酮作為提取溶劑，取5g凍干卷心菜粉，在500W超聲波功率處理下振蕩30min。從表5可以看出，5g干粉選用150mL丙酮抽提時（即料液比為1∶30），其平均葉黃素出峰面積最大，為15226mAU。方差分析表明，料液比為1∶30與1∶40時葉黃素出峰面積差異極不明顯，說明繼續增加溶劑量可能已無法提高葉黃素的抽提效率。

表5 不同料液比處理對卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 5 Effect of solid to liquid ratio on extraction yield of lutein from cabbage

表6 不同溫度處理對卷心菜中葉黃素提取量的影響Table 6 Effect of temperature during ultrasonic on extraction yield of lutein from cabbage

2.2.5 超聲處理溫度的確定 選擇150mL的丙酮作為提取溶劑，取5g凍干卷心菜粉，在500W超聲波功率處理下，于不同溫度下用超聲波500W功率振蕩30min。從表6可以看出，方差分析說明50℃與60℃下處理時，峰面積數據差異并不明顯。但60℃下抽提時，其平均葉黃素峰面積與葉黃素提取平均值都高于50℃處理。因此，后續正交實驗應對溫度處理條件進行進一步的優化。

2.3 正交實驗優化

單因素實驗表明，當提取試劑為丙酮時，超聲振動功率、超聲振動時間、料液比、處理溫度對卷心菜干粉中葉黃素的提取量都具有影響。為尋求最佳工藝，在單因素實驗的基礎上設計正交實驗，選取超聲振動功率、振動時間、料液比和處理溫度為考察因素，以葉黃素提取量為指標，取三水平按L9（34）設計正交實驗。

表7表明，極差RB＞RC＞RD＞RA。極差越大，該因素水平變動時，單位材料中葉黃素提取量變化越大。即因素B（超聲作用時間）對葉黃素提取量影響最大，其次是因素C（料液比），因素D（提取溫度）次之，因素A（超聲功率）對提取量影響最小。

表7 卷心菜葉黃素提取正交實驗設計及結果Table 7 Orthogonal array matrix and experimental results

以葉黃素提取量為指標，進行方差分析。表8方差分析顯示，FA＜FD＜FC＜FB＜F0.05=4.460，說明本實驗選取各因素對葉黃素提取量的影響均表現為不顯著。

表8 正交實驗方差分析結果Table 8 Variance analysis for extraction yield of lutein with various extraction conditions

結合表7與表8可以得出，采用丙酮為提取試劑，卷心菜干粉中葉黃素的最佳提取工藝條件為超聲功率500W，超聲處理時間30min，料液比1∶30，處理溫度60℃。在此條件下進行驗證，卷心菜干粉中葉黃素含量約為：5.6mg/100g。

3 討論與結論

葉黃素是自然界中一種重要生物活性物質，它在食品與保健品生產領域具有重要的作用。能夠從低價的食物源原料中，通過簡單易行的方法提取葉黃素，并進行精確定量定性分析，是目前葉黃素產業化研究的熱點。本研究以國內產量巨大且價格偏低的常見蔬菜－卷心菜為材料，探索了葉黃素經濟可行的新的提取方法和原料來源。

對于葉黃素的分析和檢測，國內外之前已經有很多的方法，例如：薄層層析法（TLC）、分光光度法等[10]。由于TLC分析效果較差，且無法對產物精確定量。而分光光度法則對單一葉黃素測定結果會產生一定偏差[11]。因此，人們迫切希望能探索出精確分析葉黃素的新方法。近些年來，發展起來的HPLC就是一種精確的物質分析技術。由于其試劑消耗少、樣品預處理簡單，因此在植物組織活性物質分離分析方面具有獨特優勢[12-13]。所以，HPLC技術也是目前葉黃素提取工藝研究中較為理想的產物分析方法[14-15]。

我們通過有機試劑的直接強化提取，并借助超聲波處理，簡化了常規的葉黃素皂化提取分離工藝。結果表明，通過丙酮萃取抽提，在優化了超聲波處理等條件后，卷心菜中的葉黃素能夠高效率的被提取出來。每100g卷心菜干粉中，能獲得5.6mg左右的葉黃素。

從研究結果中，我們也發現超聲波的生物學效應十分復雜，不同的作用條件下其生物學作用是不同的。雖然理論上，提取時間越長，樣品破碎越充分，則細胞中內含物被抽提的效率將會越高。但我們的實驗結果表明，在超聲波萃取葉黃素的過程中，在抽提一定時限后，即可將絕大多數水溶性成分提出。過多地延長提取時間，不僅破碎效率不會相應提高，甚至會對已生成的產物有破壞作用。另外，料液比合適時也可以提高葉黃素的產量，并減少不必要的浪費。

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Study on extraction technology of lutein from cabbage

XIE Ling1，2，CHENG Hong-mei1，YANG Ji-bin3，HUANG Bo2，*
（1.School of Life Science，Anqing Teachers College，Anqing 246011，China；2.Anhui Provincial Key Laboratory for Microbial Pest Control，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China；3.Anqing Long Ling Agro-ecological Exposition Development Co.，Ltd.，Anqing 246003，China）

Lutein from cabbage was extracted by ultrasonic，and the production was determined by HPLC.The extraction process was optimized by the orthogonal-array-design on the basis of a series of single-factor experiments.Experimental results showed that the optimal condition was as follows：acetone as extraction solvent，the power of ultrasonic 500W，treatment time of ultrasonic 30min，the extraction ratio of solid to liquid 1∶30，extraction temperature 60℃.Under the optimum conditions，about 5.6mg lutein could be extracted from 100g dried powder of cabbage.This experimental conclusion had great significance for production and commercial application of lutein.

cabbage；high performance liquid chromatography；lutein；ultrasonic

TS255.1

B

1002-0306（2012）03-0269-04

2011－10－17 *通訊聯系人

謝翎（1980-），男，講師，博士，研究方向：生物化學與分子生物學。

安徽省高校省級自然科學項目（KJ2010B091）；安慶市重點科技項目（20100808）；安慶師范學院科研啟動項目（044-K05000000281）。