CdS-BSA-CTMAB熒光光度法測定食品中蛋白質的含量

焦 嫚，董學芝，胡衛平，王 鑫

（河南大學化學化工學院環境與分析科學研究所，河南開封475004）

CdS-BSA-CTMAB熒光光度法測定食品中蛋白質的含量

焦 嫚，董學芝*，胡衛平，王 鑫

（河南大學化學化工學院環境與分析科學研究所，河南開封475004）

實驗以六偏磷酸鈉為穩定劑，巰基乙酸為修飾劑水相合成了熒光試劑CdS量子點。結果表明，牛血清白蛋白（BSA）可使CdS的熒光峰增強，而陽離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨（CTMAB）的加入，可使體系熒光峰顯著增敏，并且熒光強度與BSA濃度在8.0×10-5～1.3mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為F=1486.94793+937.70328C，相關系數R=0.9957，檢出限為7.4×10-5mg/mL。方法已用于食品中蛋白質的測定，與考馬斯亮藍法對照，結果滿意。

CdS量子點，十六烷基三甲基溴化銨，牛血清白蛋白

蛋白質是復雜的含氮有機化合物，分子量大，主要由氨基酸通過酰胺鍵以一定的方式結合起來，并具有一定的空間結構。蛋白質的測定方法主要有滴定法[1]、吸光光度法[2]、熒光法[3]、共振瑞利散射法[4]、電感耦合等離子體法[5]、流動注射法[6]等。熒光法因具有多種測定參數、選擇性好、靈敏度高等優點而應用廣泛，利用有機染料結合的熒光探針技術也倍受關注[7]。近年來，量子點（QDs）作為一種具有優異光學性質的熒光生物探針，彌補了傳統有機染料存在的缺陷，在蛋白質分析方面具有很好的應用前景[8]。近幾年，利用熒光量子點標記蛋白質分子研究其作用機理已有報道[9]，但是用該生物探針測定蛋白質的含量報道較少。本實驗以六偏磷酸鈉為穩定劑，巰基乙酸為修飾劑水相合成了熒光試劑CdS量子點，研究表明，牛血清白蛋白可使CdS的熒光峰增強，而陽離子表面活性劑CTMAB的加入，可使體系熒光峰顯著增敏，并且熒光強度（F）與BSA濃度在一定范圍內有良好的線性關系。據此，建立了CTMAB熒光增敏測定蛋白質含量的新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蛋白質儲備液（10mg/mL） 取牛血清白蛋白（BSA，國藥集團化學試劑有限公司，生化試劑，≥98%）1g，用水稀釋定容至100mL；B-R緩沖溶液 取濃度均為0.04mol/L的硼酸、磷酸、醋酸混合溶液，用0.2mol/L的NaOH調至所需pH；硼酸-硼砂緩沖溶液 取0.2mol/L的硼酸和0.05mol/L的硼砂混合調至所需pH；十六烷基三甲基溴化銨（1.10mol/L）、巰基乙酸（0.10mol/L）、六偏磷酸鈉（0.10mol/L）、CdCl2（0.10mol/L）、Na2S（0.10mol/L） 所用試劑均為分析純；實驗用水 二次蒸餾水。

F-7000熒光光度計 日本日立Hitachi公司；Labtech-1000紫外-可見分光光度計 北京萊伯泰科儀器有限公司；pHS-3CT型酸度計 上海大普儀器有限公司；CL-4型恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 CdS量子點的制備

在80mL的燒杯中，依次加入蒸餾水50mL、CdCl22mL、六偏磷酸鈉3mL、巰基乙酸5mL，用NaOH溶液調節pH到7.0。在攪拌的作用下，緩慢加入Na2S 3mL，反應2h，得到一定粒徑大小的CdS。

1.3 實驗方法

在10mL容量瓶中，加入3.0mL CdS溶液、2.5mL B-R緩沖溶液、含適量BSA的溶液，CTMAB 1.8mL，蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。于15℃反應25min，在Ex 370nm，Em 530nm處進行熒光測定。

2 結果與討論

2.1 熒光光譜

激發光譜為370nm，分別對CdS、BSA、CdS-BSA體系及含不同量CTMAB的CdS-BSA-CTMAB體系進行熒光掃描，熒光光譜見圖1。可以看出，CdS在發射光譜530nm處有最大吸收峰，BSA本身在此波長處無吸收，二者作用后使CdS-BSA復合物的熒光強度增強，而CTMAB的加入，可使體系熒光強度增敏顯著。體系的熒光強度隨BSA濃度的增大逐漸增強，并且在一定范圍內與BSA濃度呈現良好的線性關系。

圖1 熒光光譜Fig.1 Fluorescence emission spectra

2.2 pH的影響、緩沖體系及用量的選擇

圖2 酸度的影響Fig.2 Effect of acidity

配制一系列不同pH的B-R緩沖溶液，按照實驗方法，測定不同酸度下的熒光強度F，以F對不同酸度（pH）作圖（圖2）。實驗表明，當體系的pH在2.0～8.0范圍內，體系F隨pH的增大逐漸增大，且在pH為8.50時F達到最大，實驗選擇pH為8.50的緩沖溶液。實驗對硼酸-硼砂、NH3-NH4Cl及B-R緩沖溶液進行選擇，表明pH為8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液使體系熒光強度增加顯著。進一步對pH8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液的用量進行選擇，見圖3。緩沖溶液用量在0～2.0mL范圍內，F隨著緩沖溶液用量的增大逐漸增加，且在2.0mL后體系熒光強度趨于穩定，實驗選擇pH8.50的硼酸-硼砂緩沖溶液2.5mL。

圖3 緩沖溶液用量的影響Fig.3 Effect of buffer volume

2.3 CdS用量的影響

按照實驗方法，固定其他條件不變，測定體系在CdS不同用量時的熒光強度，見圖4。實驗表明，隨著CdS用量的增多，體系熒光強度逐漸增大，且在3.0mL以后趨于穩定，實驗選擇CdS的用量為3.5mL。

圖4 CdS用量的影響Fig.4 Effect of CdS volume

2.4 CTMAB溶液用量的選擇

按照實驗方法，固定其他條件不變，測定體系在CTMAB不同用量時的熒光強度，見圖5。實驗表明，CTMAB用量在0～0.8mL范圍內，隨著用量的增多體系的熒光強度逐漸增大，且在0.8～1.8mL體系熒光強度趨于穩定，大于1.8mL后熒光強度逐漸降低，實驗選擇CTMAB的用量為1.5mL。

圖5 CTMAB用量的影響Fig.5 Effect of CTMAB volume

2.5 反應溫度和時間的影響

用溫度控制儀調節水溫，在10～70℃溫度范圍內分別測定溫度對體系的影響，見圖6。結果表明，10～25℃體系的熒光強度趨于穩定，隨著溫度的繼續升高，F逐漸降低。實驗選擇溫度為15℃，測定反應時間對體系的影響，見圖7。實驗表明，反應剛開始時，體系熒光強度不穩定，20min后，熒光強度趨于穩定，因此選定反應時間為20min。

表1 樣品中BSA的測定結果Table 1 Determination results of BSA samples

表2 加標回收實驗Table 2 Recovery test

圖6 反應溫度的影響Fig.6 Effect of temperature

圖7 時間的影響Fig.7 Effect of time

2.6 工作曲線

按照實驗方法，加入不同量的BSA，測定體系的熒光強度，以熒光強度F對BSA濃度C作圖，如圖8所示。實驗表明，F與BSA濃度在8.0×10-5～1.3mg/mL范圍內呈良好的線性關系，回歸方程為F=1487+937.7C（mg/mL），相關系數R=0.9957，檢出限為7.4×10-5mg/mL。

2.7 共存離子的干擾

考察了常見的金屬離子及多種氨基酸對含有0.02mg/mL BSA體系的影響，結果表明，在±5%誤差允許范圍內，500倍的NaCl、CaCl2、KCl、尿素、蔗糖、BaCl2，250倍的甘氨酸、L-谷氨酸、MgCl2，對實驗均沒有影響，同濃度的Zn2+、Cu2+、Pb2+、Al3+、Fe3+有明顯的干擾，可加入不同的掩蔽劑進行消除。

圖8 標準曲線Fig.8 Standard curv

2.8 樣品測定及對照實驗

取新磨好的豆漿（不加熱）200mL，肉松13.8044g，分別加水稀釋并定容至100mL，超聲振蕩3h，使樣品中蛋白質充分溶解，用乙醚萃取三次，除去脂肪，過濾。即為待測液，備用。取樣品測試液，按照實驗方法測定，并與考馬斯亮藍法做對照，結果見表1。

2.9 加標回收實驗

吸取一定量的樣品測試液，分別加入一定量的BSA標準溶液，按照實驗方法做加標回收實驗。結果見表2。

3 結論

利用表面活性劑對CdS-BSA體系有增敏的作用，采用熒光法測定樣品中蛋白質的含量。該方法準確、簡單、快速、線性范圍寬，通過測定樣品并與標準方法做對照，結果滿意，可用于食品中蛋白質含量的測定。

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Determination of protein in food by CdS-BSA-CTMAB fluorometry

JIAO Man，DONG Xue-zhi*，HU Wei-ping，WANG Xin
（Henan University，Institute of Environmental and Analytical Sciences，College of Chemistry and Chemical Engineering，Kaifeng 475004，China）

CdS quantum dots（QDs）which had special spectral properties were prepared with sodium hexametaphosphate as stabilizer and mercapto-acetic acid as modifier by hydrothermal synthesis method.The results showed that the fluorescence intensity increasing after CdS reacted with novine serum albumin（BSA），but joined cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）into system，the fluorescence increasing sensitivity.And the fluorescence intensity of system had a good linear relationship with the concentration of BSA in the range of 8.0×10-5～1.3mg/mL，and the linear equation was F=1486.94793+937.70328C，relation coefficient（R）was 0.9957，the limit of detection was 7.4×10-5mg/mL.The method have been used for determination of protein in food，and compared with the standard method（Coomassie brilliant blue method），the results were satisfactory.

CdS quantum dots；cetyltrimethy lammonium bromide（CTMAB）；bovine serum albumin（BSA）

TS207.3

A

1002-0306（2012）05-0334-04

2010-05-26 *通訊聯系人

焦嫚（1985-），女，碩士，研究方向：食品與藥物分析。

國家自然科學基金資助項目（20875022）；省部共建河南大學科研項目。