一株槐樹內生真菌發酵產物對羥自由基所致小鼠肝組織過氧化的體外作用

史佳琴，陳 強，王梅霞，陳雙林

（南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210046）

一株槐樹內生真菌發酵產物對羥自由基所致小鼠肝組織過氧化的體外作用

史佳琴，陳 強，王梅霞，陳雙林*

（南京師范大學生命科學學院，江蘇南京210046）

為了研究初篩獲得的具有較高抗氧化活性和清除O2-·能力的槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物對·OH導致的氧化損傷的抑制作用及其清除·OH的效果，采用Fe2+-H2O2和Fe2+-VC兩種羥自由基發生系統，以硫代巴比妥酸法測定了小鼠肝勻漿及肝線粒體中脂質過氧化物丙二醛（MDA）含量，以分光光度法測定了小鼠肝線粒體的膨脹程度。結果表明，槐樹內生真菌No.7發酵液提取物具有清除·OH的作用，能抑制小鼠肝臟脂質過氧化，從而降低線粒體氧化損傷及腫脹。

槐樹，內生真菌發酵產物，羥自由基，抗氧化

植物內生真菌是一類存在于健康植物體內的微生物[1]，一般能夠產生與宿主植物相同或相似的生理活性物質，是具有新活性或新結構的天然物質的潛在資源庫[2-4]。國內外一些近年的研究表明，植物內生真菌具有抗氧化活性或可產生抗氧化的活性產物[5-7]?；睒銼ophora japonica L.為豆科槐屬中的木本藥用植物，含有蕓香甙、甾醇、刺槐素、槲皮素等多種抗氧化活性成分[8-9]，我們對槐樹的內生真菌的抗氧化活性進行了研究，分離到12株槐樹具有不同程度的總抗氧化活性和清除O2-·的能力的內生真菌[10]。在此基礎上，本文選擇了其中抗氧化活性和O2-·清除能力均最高的菌株No.7（鐮刀菌Fusarium sp.），研究了其發酵液提取物對·OH的清除效果以及在體外對小鼠肝組織的脂質過氧化及肝線粒體腫脹度的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

昆明種小白鼠 雌雄各半，體重（22±2）g，購自南京醫科大學；槐樹內生真菌抗氧化活性菌株No.7（鐮刀菌Fusarium sp.） 本實驗室自行分離和保存；硫代巴比妥酸（TBA）、水楊酸鈉、硫酸亞鐵（FeSO4）、維生素C（VC）、雙氧水（H2O2）、三氯乙酸（TCA）、蔗糖等 均為分析純。

超速離心機 Sigma公司；RE-52AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；LGJ1.5冷凍干燥器 北京四環實驗儀器廠；UV-2802H紫外可見分光光度計 尤尼柯上海儀器有限公司；組織勻漿器。

1.2 實驗方法

1.2.1 槐樹內生真菌培養液提取物的制備 活化保存槐樹內生真菌菌株No.7菌種，然后取少量菌絲接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，250mL三角瓶、100mL裝液量，27±1℃、150r/min培養7d。濾除菌絲，濾液用旋轉蒸發儀減壓蒸發濃縮，加入等量95%乙醇振蕩提取，5000r/min離心10min，棄去沉淀，上清液再濃縮至粘稠后真空干燥得粗提物。

1.2.2 小鼠肝線粒體懸浮液制備[11]小鼠禁食14h，斷頸脫臼處死。取小鼠肝組織在冰浴條件下加入0.25mol/L蔗糖溶液，于組織勻漿器內研磨制成10%勻漿，3000r/min、4℃離心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗兩次，合并上清液，10000r/min、4℃離心20min，沉淀用冷的0.25mol/L蔗糖溶液洗兩次，合并沉淀。所得沉淀即為線粒體，將新鮮制備的線粒體用0.02mol/L、pH7.4的Tris-HCl溶液配成吸光度為0.7～0.8的線粒體懸浮液，冰箱冷藏室中存放備用。

1.2.3 槐樹內生真菌活性菌株發酵液提取物清除·OH效果的測定 按Smirnoff的方法改進[12]。用FeSO4+ H2O2反應體系產生·OH，以·OH氧化水楊酸所得產物的吸光值表示·OH的多少，吸光值越大，·OH越多。反應總體系為3mL，依次加入0.15mmol/L FeSO4、2mmol/L水楊酸鈉以及不同濃度的樣品即菌株No.7發酵液提取物，最后加入6mmol/L H2O2啟動反應，37℃反應1h，測510nm處的吸光值。每個處理重復三次。吸光值越低，表明清除·OH效果越好。

·OH的清除率（%）={[A0-（Ai-Ai0/A0）]}×100%

其中：A0為空白對照的吸光值；Ai為含某濃度樣品時的吸光值；Ai0為無顯色劑時樣品的本底值。

1.2.4 對Fe2+－H2O2誘導肝勻漿脂質過氧化的影響[13]取小鼠的肝組織，用冷的生理鹽水洗凈后冰浴下勻漿，制成1%的懸浮液。取1%肝勻漿1mL，加入不同濃度的菌株No.7發酵液提取物樣品0.2mL，再加入6mmol/L FeSO40.1mL和60mmol/L H2O20.1mL，以0.2mL的無水乙醇代替樣品處理作為誘發·OH導致過氧化的對照組，同時設空白處理作為自發過氧化的對照。每個處理重復三次。37℃溫育1h后，加入25%TCA 1mL，終止反應，以3000r/min離心10min，取上清液，加0.67% TBA 1mL后，沸水浴15min，流水冷卻，測定532nm處的吸光值和丙二醛（MDA）含量。

對H2O2誘導過氧化時產生MDA的抑制率（%）= [（B0-Bi）/B0]×100%，其中，B0為誘發過氧化對照處理的MDA含量，Bi為某濃度樣品處理下的MDA含量。

1.2.5 對Fe2+－VC系統誘導肝線粒體腫脹度的影響[14]取線粒體懸液1.2mL，依次加入0.2mL的菌株No.7發酵液提取物樣品、0.2mL的42.5μmol/L FeSO4和0.1mL的0.85mmol/L VC，在520nm處測吸光值，每20min測一次，觀察吸光值下降情況。以不加發酵液樣品的處理為誘發·OH導致過氧化損傷的對照，每個處理重復三次。

1.2.6 對Fe2+－VC系統誘導肝線粒體脂質過氧化的影響[15]線粒體懸液1mL，依次加入0.2mL的菌株No.7發酵液提取物樣品、0.1mL的0.2mol/L pH7.4 Tris-HCl緩沖溶液、0.05mL的3.5mol/L KCl溶液、0.2mL的5mmol/L FeSO4和0.1mL的10mmol/L VC，37℃溫育1h，測定532nm處的吸光值和MDA含量，計算MDA抑制率。每個處理重復三次。

2 結果與分析

2.1 槐樹內生真菌活性菌株發酵液提取物清除·OH的效果

表1 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

表1 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物清除·OH的效果（n=3，±s）Table 1 The scavenging effect of extracts from the endophytic fungal strain No.7 on·OH（n=3，±s）

注：A為與對照相比差異極顯著（Plt;0.01）。

·OH清除率（%）空白對照CK 0 1.596±0.047處理1 50 1.312±0.004A 17.79處理2 100 1.056±0.069A 33.83處理3 200 0.424±0.018A 73.43處理4 500 0.125±0.035A 92.17處理 樣品濃度（μg/mL） A510nm

由表1的結果可以看出，槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物不同濃度樣品的各處理的A510nm值明顯低于對照，表明不同濃度的樣品均具有清除·OH的作用，且隨著樣品濃度的增加，其清除·OH的效果亦增加。當樣品濃度達到200μg/mL時，對·OH的清除率超過50%，濃度達500μg/mL時，對·OH的清除率高達92.17%。

2.2 對Fe2+-H2O2誘導肝勻漿脂質過氧化的影響

表2 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物抑制Fe2++H2O2誘發的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

表2 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物抑制Fe2++H2O2誘發的MDA的效果（n=3，±s）Table 2 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on malondialdehyde induced by Fe2++H2O2（n=3，±s）

注：與Fe2++H2O2處理相比的差異顯著性，A：Plt;0.01；a：Plt;0.05。

（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白對照CK 0 0.176±0.068 Fe2++H2O2 0 0.521±0.088 Fe2++H2O2+樣品 25 0.399±0.077A 23.42 Fe2++H2O2+樣品 50 0.311±0.025A 40.31 Fe2++H2O2+樣品 100 0.285±0.050A 45.30 Fe2++H2O2+樣品 200 0.198±0.045a 62.00處理 樣品濃度

由表2可見，Fe2++H2O2處理與對照相比的A532nm值顯著增加，說明Fe2++H2O2反應體系產生的·OH可促使小鼠肝組織體外脂質過氧化反應。Fe2++H2O2+菌株No.7發酵液提取物樣品的各處理對MDA的生成均具有抑制作用，說明槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物可抑制誘發的·OH所致小鼠肝組織體外脂質過氧化的發生，而且抑制誘發的小鼠肝組織體外脂質過氧化時產生MDA的能力隨樣品濃度增加而提高。

2.3 對Fe2+－VC系統誘導肝線粒體腫脹度的影響

表3的結果表明，隨著作用時間的延長，作為對照的模型處理組的A520nm持續下降，以處理后20min內下降的幅度最大，說明·OH誘導加速了小鼠肝線粒體在體外的氧化損傷，導致腫脹迅速加重。菌株No.7發酵液提取物樣品各處理的A520nm也逐漸下降，表明其中也發生了線粒體在體外因氧化損傷而發生腫脹，不過，含No.7發酵液提取物樣品的三組處理與Fe2++VC的模型處理相比下降緩慢，而且在相同作用時間內的A520nm值均高于空白對照，表明No.7發酵液提取物可在一定程度上抑制·OH所導致的氧化，使小鼠肝線粒體的腫脹減輕，損傷程度降低，且菌株No.7發酵液提取物濃度與減輕小鼠肝在體外因氧化損傷而導致的線粒體腫脹的效果之間具有量效關系。

表3 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物對Fe2++VC作用小鼠肝線粒體的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

表3 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物對Fe2++VC作用小鼠肝線粒體的吸光值（A520，n=3，±s）Table3 Effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on mitochondria swelling induced by Fe2++VC（n=3，±s）

注：A為與損傷對照相比差異極顯著（Plt;0.01）；a為與空白對照相比差異顯著（Plt;0.05）。

20 40 60 80 100 120空白對照CK 0.410±0.014 0.366±0.009 0.351±0.031 0.342±0.015 0.333±0.013 0.328±0.033 0.316±0.013損傷處理對照 0.403±0.012 0.286±0.007 0.266±0.016 0.262±0.040 0.256±0.026 0.253±0.031 0.245±0.048樣品（50μg/mL） 0.413±0.014 0.387±0.010Aa 0.369±0.020Aa 0.358±0.010Aa 0.350±0.015Aa 0.346±0.029Aa 0.347±0.060Aa樣品（100μg/mL） 0.421±0.021 0.415±0.011Aa 0.410±0.080Aa 0.398±0.033Aa 0.385±0.036Aa 0.376±0.028Aa 0.370±0.023Aa樣品（200μg/mL） 0.430±0.020 0.423±0.024Aa 0.420±0.027Aa 0.418±0.021Aa 0.414±0.031Aa 0.412±0.014Aa 0.409±0.032Aa處理 時間（min）0

2.4 對Fe2+－VC系統誘導肝線粒體脂質過氧化的影響

表4 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物抑制Fe2+－VC系統誘導肝線粒體脂質過氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

表4 槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物抑制Fe2+－VC系統誘導肝線粒體脂質過氧化的效果（n=3，±s）Table 4 Inhibitory effect of the extracts from the fermentation broth of endophytic fungal strain No.7 on lipid peroxidation in liver mitochondria induced by FeSO4－VC（n=3，±s）

注：A為與Fe2++VC處理相比差異極顯著（Plt;0.01）。

處理 樣品濃度（μg/mL） A532nm 丙二醛抑制率（%）空白對照CK 0 0.321±0.002 Fe2++VC 0 0.630±0.028A Fe2++VC+樣品 50 0.440±0.008A 30.16 Fe2++VC+樣品 100 0.409±0.004A 35.08 Fe2++VC+樣品 200 0.376±0.028A 40.32 Fe2++VC+樣品 400 0.339±0.029A 46.19

由表4可見，槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物能夠在體外顯著抑制FeSO4－VC系統誘導小鼠肝線粒體脂質過氧化產物MDA的生成，且在體外抑制肝線粒體脂質過氧化時產生MDA的能力隨樣品濃度增加而提高，具有較好的量效關系。提取物濃度為400μg/mL時，對Fe2+－VC系統誘導的肝線粒體MDA發生量的抑制率達46.19%，高濃度的No.7發酵液提取物對線粒體膜有較好的保護作用。

3 討論

大量的研究表明羥自由基（·OH）是體內最活潑的活性氧，可介導許多病理變化，因此對羥自由基的清除能力是評價天然產物抗氧化活性能力的重要指標之一[16-17]。丙二醛（MDA）是脂質過氧化生成的過氧化物的最終分解產物，其含量變化可反映生物膜的受損程度和細胞脂質過氧化程度，也間接反映細胞受自由基攻擊的嚴重程度。肝臟是反映脂質過氧化較為敏感的器官，所以肝臟中MDA的含量間接反映著細胞的脂質過氧化程度[18]。過氧化損傷會導致生物膜通透性增加，進而引起線粒體膨脹和紅細胞溶血等。本文在對槐樹內生真菌抗氧化活性和清除O2-·的能力研究的基礎上[10]，進一步研究了槐樹內生真菌抗氧化活性菌株No.7發酵液提取物在體外對小鼠肝勻漿和線粒體的脂質過氧化及肝線粒體腫脹度的影響。實驗處理中，不論是Fe2+-H2O2還是Fe2+-VC的·OH發生系統都能引起小鼠肝組織的體外脂質過氧化，并誘發MDA的生成。而槐樹內生真菌菌株No.7的發酵液提取物對·OH清除效果比較顯著，也能在一定程度上抑制·OH所致的膜脂質過氧化，從而降低或避免了膜系統遭受·OH損傷，保證了膜的流動性。表3中，Fe2+－VC的·OH發生系統處理的對照低于空白處理的正常組，反映出這一·OH發生系統誘發的脂質過氧化超過了自發過氧化，而添加槐樹內生真菌菌株No.7發酵液提取物樣品的處理高于空白處理的正常組，表明其在體外對誘發的過氧化和自發的過氧化都具有抑制作用，表現在能夠減輕線粒體因氧化損傷發生的腫脹，有助于維持正常的生理功能。研究結果再次證明了植物內生真菌的發酵產物具有抗氧化活性作用[5-7]，啟示人們開發和利用植物內生真菌產物生產具有保健價值或醫療價值的產品。

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Effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungus isolated from Sophora japonica on lipid peroxidation of mice liver induced by hydroxyl radical in vitro

SHI Jia-qin，CHEN Qiang，WANG Mei-xia，CHEN Shuang-lin*
（College of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China）

The antioxidative effect of fermentation broth extracts of the endophytic fungal strain No.7 isolated from Sophora japonica was studied.Hydroxy radical was generated from Fe2+-H2O2and Fe2+-VCsystem；MDA contents in liver homogenate and mitochondria were measured with thiobarbituric acid assay，and the swelling extent of mitochondria was detected by spectrophotometric methods.The results indicated that the fermentation broth extracts of this endophytic fungal strain isolated from Sophora japonica could scavenge·OH，inhibit the generation of MDA and reduce the swelling and oxidative damage of mitochondria.

Sophora japonica；fermented product of endophytic fungi；hydroxyl radical；antioxidation

TS201.4

A

1002-0306（2012）05-0366-04

2011－04－22 *通訊聯系人

史佳琴（1981-），女，碩士研究生，主要從事微生物發酵產物的活性研究。