進展期胃癌組織中EGFR和PI3K的表達及相關性

宮海濤 程永遠 程鴿 辛玲 王雪梅 姜慧峰

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，其死亡率在世界范圍居第二位［1］，嚴重威脅人類的健康和生命。胃癌也是消化系統最常見的惡性腫瘤，居我國惡性腫瘤病死率第一位。由于大多數患者在確診時已屬進展期，傳統的手術及放化療整體療效不佳。靶向治療是近年來腫瘤治療領域中的研究熱點，已在腫瘤治療中顯示出高效、低毒等特點。本研究應用免疫組化法檢測EGFR和PI3K在進展期胃癌組織中的表達情況，探討二者表達的特點及其相關性，為以EGFR和PI3K為靶點的生物制劑在進展期胃癌中的應用及聯合應用提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 標本來源收集濰坊醫學院附屬萊陽中心醫院2004年1月到2005年10月間手術切除并經病理檢查證實的進展期胃癌石蠟包埋組織標本68例。所有患者術前均未接受放化療。術后病理診斷為胃腺癌。68例患者中位年齡49歲(36～69歲)，≤60歲47例，＞60歲21例。男45例，女23例，男女比例1.96∶1。按WHO分類標準高分化腺癌19例，中低分化腺癌49例。有淋巴結轉移46例，無淋巴結轉移22例。按照AJCC(第7版)胃癌分期系統，Ⅱ期22例，Ⅲ期30例，Ⅳ期16例。并選擇同期胃潰瘍病例正常胃切除標本15例作為對照組。標本取材大小0.5 cm×1.0 cm×0.5 cm，組織標本用10%甲醛固定。所有患者術前均未接受放化療。

1.2 試劑與方法 EGFR鼠源性人單克隆抗體和PI3K鼠源性人單克隆抗體由福州邁新生物技術公司提供。采用免疫組織化學SABC法，具體操作步驟如下:石蠟切片逐級脫蠟至水，3%H2O2封閉內源性過氧化物酶10 min，高溫高壓熱修復，2%牛血清封閉20 min，滴加一抗(EGFR稀釋濃度為1∶100;PI3K稀釋濃度為1∶50)，濕盒內4℃冰箱孵育過夜后滴加二抗，室溫20 min，滴加辣根酶標記的鏈霉素，DAB顯色，脫水，透明，封片。結果判定后再進行蘇木素復染細胞核。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代第一抗體作為陰性對照。

1.3 評定標準 由兩位有臨床經驗的病理科醫生對免疫組化結果進行判讀。EGFR和PI3K陽性染色均為淡黃色、棕黃色或棕褐色，定位于細胞質或細胞膜。采用二級計分法，根據細胞染色程度分類:無著色為0分，淡黃色為1分，黃或棕黃色為2分，棕褐色為3分;根據陽性細胞所占5個以上高倍視野比例計數分為5類:5%以下為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，76%以上為4分。根據二者乘積判斷陽性等級:0分為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，5～8分為中度陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1.4 統計學方法 所有數據均采用SPSS 13.0統計軟件處理，樣本率的比較使用χ2檢驗，相關性用Spearman等級相關分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 EGFR和PI3K的表達 本研究表明，EGFR的陽性表達呈棕黃色或棕褐色，主要定位于細胞膜上，PI3K的陽性表達呈明顯棕黃色，主要定位于定位于細胞核和部分細胞質上。EGFR和PI3K的陽性表達率分別為58.82%(40/68)和76.47%(52/68)。在正常胃組織中無表達。胃癌組織中EGFR陽性表達率:在有淋巴結轉移胃癌組織中為73.91%較無淋巴結轉移27.27%明顯高(P＜0.05);TNM分期Ⅲ期、Ⅳ期的胃癌為67.39%較Ⅱ期36.36%高(P＜0.05);在有遠處轉移胃癌組織中為81.25%較無遠處轉移51.92%高(P＜0.05)。由此可見，EGFR的陽性表達與胃癌淋巴結轉移、TNM分期和遠處轉移密切相關，而在浸潤深度和分化程度等方面無差異。PI3K在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中的陽性表達率分別為63.64%(14/22)、80.00%(24/30)、87.50%(14/16)，臨床分期越晚，PI3K陽性表達率也越高(P＜0.05)，PI3K在高分化、中分化和低分化胃癌組織中陽性表達率分別為63.16%(12/19)、76.92%(20/26)、86.96%(20/23)，分化越差PI3K表達越強，但無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 進展期胃癌中EGFR和PI3K的表達及與臨床病理的關系(例，%)

2.2 EGFR和PI3K表達的相關性分析 52例PI3K表達陽性胃癌組織中有25例EGFR表達陽性，陽性率為48.08%，16例PI3K表達陰性病例中有3例EGFR表達陽性，陽性率僅為18.75%，PI3K表達陽性胃癌組織中EGFR陽性表達明顯高于PI3K陰性者(P＜0.05)，即二者在進展期胃癌組織中表達同時陽性的百分率較高，表明二者在進展期胃癌中有共同表達現象。Spearman等級相關分析表明，進展期胃癌組織中EGFR表達和PI3K之間具有顯著相關性(P＜0.05)。

3 討論

表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)廣泛表達于表皮細胞和基質細胞、部分神經膠質細胞和平滑肌細胞，在調節細胞生長和組織修復中起十分重要的作用。EGFR是受體型酪氨酸蛋白激酶，它與相應配體結合以后，主要通過PI3K通路將信號傳入細胞核，從而調節細胞的生長和分裂，進而引起腫瘤細胞增殖、增加新生血管生成、促進腫瘤浸潤和轉移。因此，高水平EGFR反映了腫瘤的高增殖、高惡性度、高術后復發率及預后不良。近年來，多篇文獻［2-8］報道EGFR在胃癌組織中存在過度表達，過度表達率基本在40% ～65%之間，而對照組［3，4］正常胃黏膜組織中EGFR無陽性表達，陽性率為零。據此可以確定在正常胃組織中EGFR的表達很低，而在胃癌組織中存在著過度表達。本研究EGFR在胃癌組織中的表達率為58.82%(40/68)，其過度表達率明顯高于正常胃組織，且與腫瘤的淋巴結轉移、遠處轉移和臨床TNM分期有關。因此，EGFR過度表達可作為判斷胃癌預后不良的重要指標。

磷脂酸肌醇-3激酶(PI3K)是由Sugimoto等于1984年發現的一種胞內磷脂酰肌醇激酶，是磷脂激酶家族中的一個重要成員，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，通過多種途徑進行與細胞生長及存活有關的信號傳導。國內外研究發現PI3K在卵巢癌［9，10］發生、發展中起重要作用。PI3K是T淋巴細胞內重要的信號傳導分子，通過激活下游底物蛋白激酶B(Akt)介導的信號傳導通路，具有促進細胞增殖、抑制細胞凋亡、促進骨架蛋白重排、促進細胞間粘附等功能。本研究PI3K在進展期胃癌組織中表達率為76.47%(52/68)，呈過度表達特征，明顯高于正常胃組織，差異有顯著性，提示PI3K的高表達與胃癌的形成及進展有關。

本實驗研究了進展期胃癌組織中EGFR和PI3K表達的相關性，在進展期胃癌組織中EGFR和PI3K二者存在著共同高表達現象。實驗結果經過Spearman等級相關分析表明，進展期胃癌組織中EGFR和PI3K具有顯著正相關。對二者病理特點及其相關性的研究為靶向EGFR抑制劑和靶向PI3K抑制劑在進展期胃癌綜合治療中的應用或聯合應用提供了一定的分子學依據。

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