甲基強(qiáng)的松龍對(duì)脊髓半橫斷大鼠腓腸肌乙酰膽堿酯酶表達(dá)的影響

高杰，巴方，李洪鵬

（1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖教研室，沈陽(yáng)110001，2.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院康復(fù)科，沈陽(yáng)110006）

急性脊髓損傷是嚴(yán)重的外傷，致死率、致殘率很高，給患者、家庭和社會(huì)造成極大的痛苦和負(fù)擔(dān)。臨床上已開始嘗試大劑量甲基強(qiáng)的松龍（methylprednisolone，MP）沖擊治療急性脊髓損傷［1］，可能的作用機(jī)制是減輕脊髓損傷處炎癥和水腫，減少壓迫，降低炎性因子、自由基等有害物質(zhì)的產(chǎn)生與釋放，具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)大鼠脊髓半橫斷后早期MP干預(yù)，檢測(cè)腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的表達(dá)，初步探討MP對(duì)脊髓半橫斷后大鼠運(yùn)動(dòng)終板AChE的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年健康雄性Wistar大鼠共96只，SPF級(jí)，體質(zhì)量200～250 g，由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供〔使用許可證號(hào)SYXK（遼）2008-0005〕，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組，n=16）、脊髓半橫斷組（B組，n=40）和脊髓半橫斷后甲基強(qiáng)的松龍治療組（C組，n=40）。

1.2 脊髓半橫斷模型

大鼠用10%水合氯醛3 mL/kg腹腔注射麻醉，俯臥位固定，在約T8～T10水平做后正中切口，逐層切開組織，暴露T9～T10棘突；咬除棘突和錐板，暴露脊髓；在T9～T10間用手術(shù)刀片以脊髓后正中動(dòng)脈為標(biāo)志橫斷右側(cè)脊髓，以鼠產(chǎn)生翹尾反應(yīng)為脊髓半橫斷成功標(biāo)準(zhǔn)。生理鹽水沖洗、碘伏消毒后逐層縫合。假手術(shù)組為對(duì)照組，同法暴露T9～T10段脊髓后再予縫合，不損傷脊髓。術(shù)后大鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，分籠清潔飼養(yǎng)，每日2次適度按摩擠壓膀胱，直到排尿反射建立。

1.3 MP干預(yù)

注射用甲基強(qiáng)的松龍（SOLU-MEDROL）為法瑪西亞公司產(chǎn)品，包括粉劑及配套稀釋液。C組給予MP治療，術(shù)后即刻尾靜脈注射，首次劑量30 mg/kg，1 h后按5.4 mg·kg-1·h-1計(jì)算23 h需要量，分4次（每次間隔6 h）進(jìn)行腹腔注射給藥［2］。

1.4 取材、切片

B組和C組分別于術(shù)后1 d、3 d、1周、2周、4周隨機(jī)各取8只大鼠處死，取右下肢帶神經(jīng)的腓腸肌，剔除筋膜；A組16只大鼠于術(shù)后第1天處死取材，作為對(duì)照標(biāo)本。標(biāo)本浸入4%多聚甲醛固定24 h，30%蔗糖浸泡沉底，OCT（聚乙二醇和聚乙烯醇混合物）包埋，恒低溫切片機(jī)-20℃環(huán)境下，與肌束垂直方向、于腓腸肌中段橫切，切片厚度10 μm。

1.5 AChE活性染色

采用銅-鐵氰化物改良染色法，AChE陽(yáng)性表達(dá)物在光學(xué)顯微鏡下呈紅色或棕色；試劑盒購(gòu)自GENMED SCIENTIFICS公司（貨號(hào)GMS80031.2 vA），具體操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行。

1.6 圖像采集和分析

采用Leica DFC200顯微鏡及DFC280顯微照相系統(tǒng)，觀察AChE的表達(dá)；并采用Image Pro Plus 6.0高清晰圖像分析系統(tǒng)測(cè)量腓腸肌AChE陽(yáng)性表達(dá)物的平均光密度值。每例標(biāo)本隨機(jī)取4張切片，于每張切片4個(gè)象限各取1個(gè)視野，測(cè)量視野內(nèi)所有陽(yáng)性表達(dá)物的光密度值并取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0軟件，各組數(shù)據(jù)均滿足正態(tài)分布和方差齊性，數(shù)據(jù)表示為±s，采用單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)分別比較各組平均光密度值，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板AChE的組織化學(xué)染色結(jié)果

A、B、C組大鼠腓腸肌冰凍切片中均有AChE的表達(dá)，染色后呈棕色顆粒狀，富集于肌纖維的邊緣，著色較均勻，1根肌纖維上只能見1處棕染區(qū)。3組切片之間棕色顆粒表達(dá)的數(shù)量、面積、染色深淺存在區(qū)別，脊髓半橫斷大鼠腓腸肌切片上AChE陽(yáng)性表達(dá)區(qū)域有所減少，染色深度也較淺；在B組或C組內(nèi)部，術(shù)后不同時(shí)間段取材的標(biāo)本，AChE陽(yáng)性表達(dá)顆粒的數(shù)量、面積、染色深淺也存在區(qū)別。見圖1。

2.2 3組大鼠腓腸肌運(yùn)動(dòng)終板AChE陽(yáng)性表達(dá)比較（表1）

脊髓半橫斷術(shù)后1 d，A、B和C組大鼠腓腸肌切片中AChE染色區(qū)的平均光密度值3組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.403）。術(shù)后3 d，B、C 組 AChE 染色區(qū)平均光密度值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.874）。B、C組均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.014，0.007）；術(shù)后1周、2周，B 組 AChE 染色區(qū)平均光密度值均低于C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.047，0.039）；B、C 組 AChE 染色區(qū)平均光密度值均低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.019、0.038 和0.036、0.042）；術(shù)后 4 周，C 組AChE染色區(qū)平均光密度值明顯恢復(fù)，與A組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.273）；B組仍維持低水平，平均光密度值低于A、C組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P分別為0.031，0.048）。

3 討論

脊髓損傷包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷兩個(gè)部分，原發(fā)性損傷為致傷因素對(duì)脊髓的直接破壞，通常損傷不可逆；繼發(fā)性損傷指致傷因素作用后繼發(fā)的一系列病理生理學(xué)變化，包括脊髓以及神經(jīng)根、椎管等周圍組織水腫、微循環(huán)障礙、缺血壞死、再灌注損傷、離子平衡失調(diào)、炎性因子及神經(jīng)毒性因子釋放、自由基損傷等，繼發(fā)性損傷可以預(yù)防和逆轉(zhuǎn)。糖皮質(zhì)激素具有強(qiáng)大的抑制炎癥、改善微循環(huán)、減輕組織水腫等作用，有很多學(xué)者嘗試在脊髓損傷后早期大劑量糖皮質(zhì)激素沖擊療法，以期盡量減少繼發(fā)性脊髓損傷［3～7］。

AChE來(lái)源于運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元胞體，通過(guò)軸突快速運(yùn)輸?shù)竭_(dá)神經(jīng)終末；組織化學(xué)中，AChE在運(yùn)動(dòng)終板表達(dá)。AChE的活性可反映運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的功能狀態(tài)，AChE濃度也能夠反映運(yùn)動(dòng)終板退變及再生情況；周圍神經(jīng)離斷后遠(yuǎn)端及去神經(jīng)支配骨骼肌的AChE活性明顯減低，而AChE陽(yáng)性反應(yīng)的出現(xiàn)可認(rèn)為是神經(jīng)纖維再生標(biāo)志［8～10］。

大鼠脊髓損傷后，運(yùn)動(dòng)終板AChE表達(dá)水平下降［11］；早期糖皮質(zhì)激素干預(yù)，其AChE較早得以恢復(fù)。在本實(shí)驗(yàn)中，大鼠脊髓半橫斷后，運(yùn)動(dòng)終板AChE的表達(dá)進(jìn)行性下降：脊髓損傷后1 d，AChE表達(dá)下降并不明顯；損傷后1～3 d，AChE表達(dá)下降最為顯著；至損傷后第4周仍維持下降趨勢(shì)。脊髓半橫斷后早期使用MP干預(yù)的大鼠，運(yùn)動(dòng)終板AChE的表達(dá)雖然也明顯下降，但術(shù)后第1周即開始呈緩慢恢復(fù)，至第4周已接近正常水平。由此推測(cè)，MP除了能減輕脊髓損傷后周圍組織的水腫、炎癥，還有可能影響到運(yùn)動(dòng)終板的神經(jīng)傳遞介質(zhì)的釋放。

糖皮質(zhì)激素可減輕和逆轉(zhuǎn)繼發(fā)性脊髓損傷，脊髓及神經(jīng)根功能得以早期恢復(fù)，其神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用間接改善周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元蛋白酶類的表達(dá)，因此可以認(rèn)為糖皮質(zhì)激素恢復(fù)AChE表達(dá)水平是“間接作用”。有學(xué)者認(rèn)為組織內(nèi)AChE水平受到機(jī)體內(nèi)激素水平的調(diào)控：外源性糖皮質(zhì)激素作用于大鼠（并非脊髓損傷大鼠），能影響肝臟和大腦中AChE的合成、分泌［12］以及肌肉中 AChE 的表達(dá)［13］，提示糖皮質(zhì)激素影響外周組織AChE的表達(dá)可以是“直接作用”，并不通過(guò)脊髓這個(gè)中間環(huán)節(jié)。Yamate等［14］發(fā)現(xiàn)雞胚神經(jīng)中樞發(fā)育可能受到糖皮質(zhì)激素的調(diào)控，倍他米松干預(yù)能夠通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體mRNA表達(dá)上調(diào)的途徑，增加腦內(nèi)AChE的表達(dá)，繼而影響仔雞出生后大腦的重量。糖皮質(zhì)激素是通過(guò)何種途徑影響運(yùn)動(dòng)終板AChE的表達(dá)，目前還沒(méi)有這方面的報(bào)道；“直接作用”的具體機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。

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