高GChTwist融合蛋白載體構建及其表達條件優化

王利利，劉彩紅，朱亞勤

（教育部醫學細胞生物學重點實驗室，細胞病理生物學研究室，中國醫科大學基礎醫學院細胞生物學教研室，沈陽110001）

Twist是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋結構的轉錄因子，最早在果蠅體內被發現。在幼稚中胚層細胞和中胚層起源器官中表達最多，出生后降至低水平［1，2］。研究表明，Twist在分化過程中起到重要作用。越來越多的證據顯示，TWIST還參與人類多種腫瘤的發生發展過程。某些腫瘤中TWIST的高表達與其臨床分期以及較差的預后相關［3～5］。同時，在體內，TWIST高表達的腫瘤細胞系有較強的轉移能力；在體外，TWIST可誘發細胞發生上皮向間質轉化［6］、增強細胞生存能力［7］、誘發血管生成［8］、提高腫瘤細胞對化療藥物的抵抗能力［9］。目前發現TWIST的下游靶基因（如E-鈣粘素、N-鈣粘素等）與腫瘤的發生發展相關，但其具體機制尚不清楚。

Twist基因GC含量高達75%，甚至局部區域GC含量高達90%以上，其中有連續的30個GC，具有復雜的二級結構。GC含量高達70%以上時，利用PCR很難理想地進行擴增。主要因為G、C之間形成三對氫鍵，解鏈所需能量較高，故模板較難解鏈。在常規變性溫度下，DNA模板變性不完全，同時由于單鏈的GC豐富區易自身互補配對形成穩定的發夾環二級結構，而使PCR引物難于結合到模板上，DNA聚合酶也難于延伸或停止延伸，結果常出現嚴重的非特異性條帶，甚至導致靶基因擴增失敗。本研究中我們比較3種DNA聚合酶，經優化，選擇Platinum pfx DNA聚合酶作為高GC基因Twist擴增DNA聚合酶，配合優化的PCRx加強緩沖液的使用及改良降落PCR策略的實施，獲得高效特異的高GC含量Twist全長編碼基因，利用基因重組技術成功構建了pGEX-5X-1-Twist原核表達質粒，表達并純化GST/TWIST融合蛋白，并利用Western blot方法對其進行鑒定，為今后研究TWIST的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達載體 pGEX-5X-1，E.coliDH5α 和BL21菌株由本實驗室保存。兔抗TWIST多克隆抗體購自Abcam公司，HRP標記山羊抗兔二抗購自北京鼎國公司。RNA提取試劑盒、限制性內切酶，T4 DNA 連接酶、DNA Marker、rTaq DNA 聚合酶、LA Taq DNA聚合酶購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒購自Axygen公司；小量質粒提取試劑盒購自Omega公司；Platinum pfx DNA聚合酶購自Invitrogen公司；反轉錄酶、RNA酶抑制劑購自Promega公司；ECL試劑盒購自Pierce公司；引物序列合成和DNA測序由Invitrogen公司完成。

1.2 高GC Twist全長原核表達載體的構建

提取細胞系SGM7901總RNA，經反轉錄得到cDNA。并以此cDNA為模板，PCR擴增Twist全長。PCR 反應體系25 μL，10×pfx 擴增緩沖液2.5 μL，10×PCRx加強緩沖液2.5 μL，10 mmol/L dNTP 混合液0.5 μL，50 mmol/L MgSO40.5 μL，上下游引物（各10 μmol/L）1 μL，cDNA1μL，Platinum pfx DNA 聚合酶0.2 μL，滅菌蒸餾水補至25 μL。PCR（改良降落PCR）反應條件為94℃預變性2 min后，進行如下循環：94℃變性20 s，60℃退火30 s，68℃延伸1min，循環5次；然后，94℃變性20 s，55℃退火30 s，68℃延伸1 min，循環30次；最后，68℃延伸10 min。凝膠回收純化產物后，用Bam HI和Xho I雙酶切，凝膠回收純化產物，與經同樣酶切處理的原核表達載體pGEX-5X-1連接，轉化感受態細胞E.coliDH5α，37℃培養過夜，挑取單克隆，接種于含氨芐西林的3 mL Luria-Bertani（LB）培養液中，37℃振蕩培養12～16 h。用堿裂解法制備質粒DNA，用Bam HI和Xho I雙酶切鑒定重組質粒，并送Invitrogen公司測序，經測序正確后，將構建的質粒命名為pGEX-5X-1-Twist。

1.3 高GC Twist重組質粒的誘導表達及純化

將測序鑒定正確的重組質粒pGEX-5X-1-Twist轉化到E.coliBL21中，挑取5個單克隆，經菌液PCR鑒定陽性克隆。將陽性克隆接種到含氨芐西林的LB培養液中，37℃振蕩過夜后，以1∶100將菌液稀釋，37℃培養至OD600為0.6左右時，加入終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L 的 IPTG，30 ℃誘導培養3、4、5 h，收集菌體，加入50 μL2×SDS 緩沖液，100℃煮沸5 min，12000 r/min離心5 min，取上清進行12%SDS-PAGE電泳分離。然后進行考馬斯亮藍（R250）染色，脫色后觀察結果。

確定好最適的IPTG濃度和最佳誘導時間后，大量誘導富含GC的GST/TWIST融合蛋白表達，收集菌體，每100 mL菌液加入1.5 mL細菌裂解液，超聲破碎后收集上清液，加入處理好的GST beads，4℃，18 r/min混合旋轉3 h，4℃，500g，2 min離心收集結合后的 beads，加入500 μL NP40 buffer 4 ℃，18 r/min混合旋轉10 min，洗滌beads去除非特異性結合，500g離心收集beads，重復上述過程2次。

1.4 Western blot分析

將上述純化后的蛋白經12%SDS-PAGE凝膠分離，70 V恒壓轉移至PVDF膜上，4℃3 h，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗TWIST抗體，4℃過夜，TBST洗膜15 min×3，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠 IgG 的二抗（1∶5000），室溫下輕搖1h，TBST洗膜15 min×3，ECL顯色檢測GST/TWIST融合蛋白。

2 結果

2.1 高效擴增高GC含量Twist全長編碼基因PCR條件的建立

本研究分別使用了rTaq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、Platinum pfx DNA聚合酶。配合其不同的PCR緩沖液，比較并分析3種DNA聚合酶的擴增效率和特異性，結果如圖1。其中Platinum pfx DNA聚合酶配合優化的PCRx加強緩沖液的使用，同時采取改良降落PCR的反應條件，其擴增效率及特異性最高（圖1b）。其他2個聚合酶在匹配的反應離子強度和PCR條件下只可見微弱的產物帶形成，見圖1a，與圖1b結果比較有極其顯著的不同。

2.2 高GC含量Twist全長原核表達載體的構建及鑒定

將重組質粒pGEX-5X-1-twist經Bam HI和XhoI雙酶切后，得到約5000bp和600bp的兩條帶，與預期結果相符（圖2）并經測序鑒定正確，無移碼突變。

2.3 高GC含量pGEX-5X-1-Twist重組質粒在E.coliBL21中的誘導表達

將構建的富含GC的Twist原核表達質粒pGEX-5X-1-Twist轉化到E.coliBL21中，挑取單克隆菌落進行誘導表達，IPTG濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L，誘導時間分別為3、4、5 h，誘導結束后用12%SDS-PAGE電泳進行分離，重組質粒在47 kDa附近出現一明顯的特異性蛋白帶，其分子量與預期相符（圖3）。

2.4 GST/TWIST融合蛋白的Western blot鑒定

用抗TWIST抗體對GST/TWIST全長融合蛋白的表達進行Western blot鑒定。結果可見在47 kDa附近出現一明顯的特異性結合抗體的條帶（圖4），說明表達并純化的GST/TWIST融合蛋白，與預期結果一致。

3 討論

Twist基因結構復雜，GC含量高達75%，甚至局部區域GC含量高達90%以上，其中有連續的30個GC，具有復雜的二級結構。所以PCR擴增和測序均存在很大難度。高GC含量模板擴增所面臨的主要難點是模板中容易形成穩定的二級結構，妨礙DNA聚合酶在模板上的推進，以及模板上可能存在多個非特異性的引物局部復性位點，導致非特異性擴增［10］。克服這些問題可以從引物的設計、反應體系和反應條件的優化等方面來考慮。在引物設計上，應盡量使用Tm值較高的引物。一些研究者認為引物結合部位要盡量遠離GC富集區域，引物的GC含量40%～60%比較合適。GC含量高的引物和GC含量高的模板結合緊密，在一輪PCR反應后兩端難以解開，也會影響擴增效率。此外，盡量應用較長的引物以增加引物與模板配對的能力與特異性；也有學者認為在能保證PCR擴增的特異性和有效性的條件下，盡量縮短引物長度來提高PCR擴增效率等。在PCR的反應條件上，有人采用退火溫度較高的一般PCR反應條件，或采用熱啟動PCR方法，也有報道提示降落PCR或者slowdown PCR可以提高高GC基因PCR的擴增效率［11］。另外，Mg2+濃度、dNTP濃度、引物濃度、模板等也影響PCR的產量及產物特異性。濃度過高反應特異性降低，過低則PCR產物產量減少，即高特異的反應條件可能與高產量的反應條件不一致。標準的TD-PCR［10］一般需設置多個退火溫度，程序比較復雜，而且特異性產物量較少。本研究的降落PCR結合不同理論和試驗經驗，設置了容易操作的兩個不同退火溫度，程序簡單，特異性產物豐度高，獲得良好的試驗反應效果。

在進行原核表達時，目前有很多以融合蛋白為表達形式的載體。這樣既有利于融合蛋白的純化，又可以防止表達蛋白被宿主菌體內的蛋白酶降解，保護目的蛋白的活性。表達的融合蛋白可進一步通過谷胱甘肽瓊脂柱進行親和層析，再用凝血酶將GST標簽切除，從而獲得目的蛋白。本研究中，我們采用pGEX-5X-1載體，這類載體含有高效的原核表達啟動子，能夠在大腸埃希菌中高效表達融合蛋白。我們發現在較寬的IPTG濃度及誘導時間范圍內，pGEX-5X-1-Twist融合蛋白的表達量基本一致，并且表達量較高。由于高濃度的IPTG對菌體具有毒性。因此，在劑量依賴范圍內我們選用適宜的較低的IPTG濃度做為大量誘導條件。

Twist最初在果蠅體內被發現，大多數的研究主要集中在Twist在生長發育中的作用。新近發現Twist具有癌基因的特征，在人類腫瘤的發生、發展、愈后、復發中具有重要作用，在人類多種惡性腫瘤中高表達，而正常組織和惡性程度低的癌細胞中無或極低表達。我們在國際上首先報告了TWIST受到TFF肽的調節從而抑制P65介導的細胞因子的釋放［12］，但其具體的分子應答機制尚不清楚。TWIST的分子機制研究將為人們深入了解TWIST與腫瘤的生長、代謝、侵襲和轉移的關系奠定基礎，也為它在炎性相關性腫瘤發生中的作用奠定基礎，同時也為腫瘤的治療提供新的途徑。高GC hTwist融合蛋白表達載體的成功構建及體外表達純化為進一步研究TWIST的生物學功能奠定工具基礎。

［1］Bialek P，Kern B，Yang X，et al.A twist code determines the onset of osteoblast differentiation［J］.Cell，2004，6（3）：423-435.

［2］Castanon I，Von Stetina S，Kass J，et al.Dimerization partners determine the activity of the Twist bHLH protein during Drosophila mesoderm development［J］.Development，2001，128（16）：3145-3159.

［3］Zhang Z，Xie D，Li X，et al.Significance of TWIST expression and its association with E-cadherin in bladder cancer［J］.Hum Pathol，2007，38（4）：598-606.

［4］Yu Q，Zhang K，Wang X，et al.Expression of transcription factors snail，slug，andtwistinhumanbladdercarcinoma［J］.JExpClinCancer Res，2010，29（1）：119.

［5］Ohuchida K，Mizumoto K，Ohhashi S，et al.Twist，a novel oncogene，is upregulated in pancreatic cancer：clinical implication of Twist expression in pancreatic juice［J］.Int J Cancer，2007，120（8）：1634-1640.

［6］Sun S，Ning X，Zhang Y，et al.Hypoxia-inducible factor-1alpha induces Twist expression in tubular epithelial cells subjected to hypoxia，leadingtoepithelial-to-mesenchymaltransition ［J］.KidneyInt，2009，75（12）：1278-1287.

［7］Yang MH，Wu KJ.TWIST activation by hypoxia inducible factor-1（HIF-1）：implications in metastasis and development［J］.Cell Cycle，2008，7（14）：2090-2096.

［8］Hu L，Roth JM，Brooks P，et al.Twist is required for thrombin-induced tumor angiogenesis and growth［J］.Cancer Res，2008，68（11）：4296-4302.

［9］Marques RB，Dits NF，Erkens-Schulze S，et al.Bypass mechanisms of the androgen receptor pathway in therapy-resistant prostate cancer cell models［J］.PLoS One，2010，5（10）：e13500.

［10］Frey UH，Bachmann HS，Peters J，et al.PCR-amplification of GC-rich regions：′slowdown PCR′［J］.Nature Protocols，2008，3（8）：1312-1317.

［11］Bachmann HS，Siffert W，Frey UH.Successful amplification of extremely GC-rich proregions using a novel‘slowdown PCR’technique［J］.Pharmacogenetics，2003，13（12）：759-766.

［12］Zhu YQ，Tan XD.TFF3 modulates NF-{kappa}B and a novel negative regulatory molecule of NF-{kappa}B in intestinal epithelial cells via a mechanism distinct from TNF-{alpha}［J］.Am J Physiol Cell Physiol，2005，289（5）：1085-1093.