IDO基因轉染對裸鼠體內宮頸癌種植瘤生長的影響

王冬冬，王曉黎，林蓓

（中國醫科大學1.附屬盛京醫院婦產科，沈陽110004；2.附屬第一醫院內分泌科，沈陽110001）

吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine2，3-dioxygenase，IDO）是色氨酸沿犬尿氨酸代謝途徑中第一步的限速酶，IDO過多表達可導致色氨酸缺乏和其代謝產物蓄積。前者可使細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞數量減少［1］，后者可使自然殺傷細胞殺傷功能減弱［2］，從而產生腫瘤免疫耐受。腫瘤免疫耐受和宮頸癌的發生、發展密切相關［3］。因此，研究IDO在宮頸癌免疫耐受中的作用是近期研究的新熱點。本研究通過IDO基因轉染宮頸癌SiHa細胞，研究IDO對裸鼠體內宮頸癌種植瘤生長的作用，以證明IDO是否可以作為宮頸癌基因治療的潛在新靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

宮頸癌細胞株SiHa培養在含10%新生牛血清、100 IU/mL青霉素、0.1 mg/mL鏈霉素的RPMI1640培養基中，置于37℃、5%CO2的條件下培養。

1.2 基因轉染

用標準磷酸鈣沉淀方法將IDO基因表達載體pcDNA3.1-IDO［4］和空白對照載體 pcDNA3.1（加拿大Invitrogen公司）轉染宮頸癌SiHa細胞，經抗生素篩選后得到IDO穩定表達的SiHa/IDO細胞株和SiHa/Mock對照細胞株。

1.3 Western blot檢測轉染細胞IDO蛋白的表達

選擇耐藥克隆株，應用Western blot檢測IDO和內參β-actin蛋白表達。待3種細胞（SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO）細胞融合度達到95%時收集細胞，NP-40裂解液裂解后離心取上清，用蛋白測定試劑盒（新西蘭BioRad公司）檢測蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳后電轉至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，抗人IDO 抗體（TBST溶液1∶1000稀釋）孵育過夜，TBST沖洗3次，二抗（TBST溶液1∶1000稀釋）孵育1 h，TBST沖洗3次后曝光顯影。PVDF膜經蛋白剝離液洗脫后，5%脫脂奶粉封閉，用抗β-actin抗體重復上述步驟。

1.4 細胞生長曲線的測定

應用MTT試劑盒（美國Genmed公司），每孔100個細胞接種于96孔培養板中，每孔體積200 μL，將培養板移入CO2孵箱中，在37℃培養，每24 h在酶聯免疫檢測儀上測定各孔光吸收值，以時間為橫軸、光吸收值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.5 動物模型的建立

BALB/c裸鼠，6～8周齡，雌性，由中國醫科大學動物實驗中心提供，SPF條件下飼養。分別將5×106個SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO細胞經胰酶消化收集后，經PBS洗滌2次，重懸于100 μL PBS中，皮下注射于裸鼠右側背部，每組5只裸鼠，共15只。

1.6 種植腫瘤體積的計算

腫瘤細胞皮下接種后，待1周后皮下腫瘤結節形成，開始每周2次測量裸鼠背部種植腫瘤的長度和寬度，腫瘤體積按照如下公式計算：腫瘤體積（mm3）=腫瘤長度×腫瘤寬度2/2。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 IDO蛋白表達

IDO蛋白在SiHa/IDO細胞中表達陽性，在SiHa和SiHa/Mock細胞中無表達（圖1）。

2.2 腫瘤細胞體外生長曲線

SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO細胞在體外生長速度差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.3 裸鼠種植腫瘤生長曲線

SiHa、SiHa/Mock和SiHa/IDO細胞分別接種裸鼠1周后，在裸鼠背部皮下均可見腫瘤小結節，3周后接種SiHa/IDO細胞的腫瘤與接種SiHa和SiHa/Mock細胞的腫瘤相比生長迅速，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3。

3 討論

宮頸癌發病率在女性惡性腫瘤中占第二位［5］。宮頸癌的發生、發展是個以持續人乳頭瘤病毒感染為開始的多步驟的復雜過程［6］，在此過程中人乳頭瘤病毒編碼的原癌基因蛋白E6和E7從最開始的宮頸皮內瘤樣病變到進展期宮頸癌病變中都有分泌。機體內免疫監視和免疫抑制狀態直接影響了宮頸癌的發生和發展。IDO是細胞內一種含亞鐵血紅素的酶，廣泛分布于人和其他哺乳動物除肝臟以外的其他組織中，是肝臟以外唯一可催化色氨酸沿犬尿酸途徑進行分解代謝的限速酶，可以將色氨酸分解為L-犬尿酸、吡啶甲酸和喹啉酸等多種代謝物。IDO通過抑制細胞毒性T細胞和自然殺傷細胞的作用，產生腫瘤免疫抑制，促進腫瘤的發生和發展。Uyttenhove等［7］首次報道了IDO在人腫瘤組織中有表達，包括前列腺癌、結腸癌、胰腺癌、胃癌等。婦科腫瘤中，IDO在宮頸癌、卵巢癌和子宮內膜癌組織中均有表達。最近有研究表明，IDO不僅和宮頸癌的發生密切相關［8］，而且可作為宮頸癌判斷預后的指標［9］。

目前宮頸癌常規的治療方法是手術或者放療，以及手術和放療相結合的綜合治療。許多醫療機構將對根治術后患者實行新輔助化療作為常規治療［10］。但是仍有相當一部分患者存在術后復發和遠處轉移。因此，尋求手術、放療、化療之外的基因靶向治療和免疫治療方法作為宮頸癌的治療方法，是目前研究的任務。

本研究應用IDO基因表達載體pcDNA3.1-IDO穩定轉染宮頸癌細胞SiHa，獲得IDO高表達宮頸癌細胞SiHa/IDO，體外細胞增長曲線顯示，IDO高表達對宮頸癌細胞體外生長速度無影響，但IDO可以加速裸鼠體內宮頸癌細胞的生長，因此，可以通過抑制IDO表達抑制腫瘤在體內的生長速度。在婦科腫瘤中，IDO蛋白在腫瘤組織中的表達與宮頸癌、卵巢癌及子宮內膜癌的預后密切相關，可以作為評價預后的指標［11～13］。本研究結果表明，IDO蛋白表達宮頸癌細胞與無IDO蛋白表達宮頸癌細胞相比，在裸鼠體內腫瘤生長速度顯著提高，因此，如果通過基因治療的方法抑制IDO蛋白的表達可以減慢宮頸癌細胞體內生長速度，從而抑制宮頸癌的進展。由此可見，IDO不僅可以作為宮頸癌評價預后的指標，也是宮頸癌基因治療一個潛在的新靶點。

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［11］Inaba T，Ino K，Kajiyama H，et al.Indoleamine2，3-dioxygenase expression predicts impaired survival of invasive cervical cancer patients treated with radical hysterectomy［J］.Gynecologic Oncology，2010，117（3）：423-428.

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