白念珠菌支氣管肺感染大鼠肺組織Toll樣受體2和IL-10的表達及意義

林莉，王莉，周洋洋，陳耀華，孟新麗，康健

（中國醫科大學呼吸疾病研究所，沈陽110001）

白念珠菌是條件致病性真菌，肺念珠菌的感染及加重與機體的免疫功能有密切關系。近年來Toll樣受體2（Toll like receptor2，TLR2）在念珠菌感染中的作用受到關注［1，2］。TLR2作為重要的天然免疫病原識別受體之一，是抵御侵襲性深部真菌感染的第一道防線。TLR2通過識別念珠菌細胞壁成分，介導一系列前炎性細胞因子的釋放，特別是對IL-10的調節作用，能夠誘導念珠菌感染的發生和加重［3，4］。

本研究通過建立白念珠菌支氣管肺感染大鼠模型，觀察感染后肺組織中TLR2和IL-10水平的變化，探討TLR2、IL-10在白念珠菌支氣管肺感染免疫調節和發病機制中作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

6周齡 SD 大鼠36只，體質量（250±50）g，由中國醫科大學實驗動物中心提供。標準白念珠菌菌株（編號070908853）由中國醫科大學第一附屬醫院檢驗科微生物室提供。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組：將動物隨機分為對照組、免疫低下組和感染組，每組各12只。

1.2.2 白念珠菌混懸液的制備［5］：取標準白念珠菌菌株，使用沙堡培養基在28℃真菌培養箱傳代培養1代，使用濁度法將白念珠菌混合配制成混懸液，使用濁度計調整菌量為（1～5）×108cfu/mL。

1.2.3 建立免疫功能低下動物模型：參照文獻［6，7］，用醋酸氫化可的松80 mg/kg，隔日1次，共7次給與大鼠皮下注射，成功制成免疫低下模型。

1.2.4 建立感染動物模型：成功建立動物免疫功能低下模型后的第2天開始，用4%水合氯醛（0.03 mL/g）腹腔注射麻醉動物，麻醉成功后，感染組經氣管插管注射白念珠菌混懸液0.2 mL/只，正常組及免疫低下組經氣管插管注射同等劑量的生理鹽水。

1.2.5 分離肺組織及血清：感染后3 d和7 d分別隨機選取各組6只大鼠，取約0.5 cm×0.5 cm×0.4 cm右肺下葉組織4%多聚甲醛固定；取1g右肺下葉肺組織勻漿處理留取上清液。

1.2.6 觀察指標

1.2.6.1 肺組織肉眼和顯微鏡下變化 肉眼觀察大體變化。右下葉肺組織制成石蠟切片，行常規HE染色及PAS染色。

1.2.6.2 免疫組織化學法檢測肺組織TLR2的表達應用免疫組織化學染色法檢測肺組織TLR2蛋白的表達，Image-pro plus 6.0圖像分析系統測定肺組織TLR2陽性細胞的積分光密度（integral optical density，IOD）值，以IOD值反映肺組織切片中相應陽性物質的表達程度。

1.2.6.3 肺組織勻漿上清液IL-10的測定 應用ELISA方法，嚴格按照IL-10試劑盒說明進行操作，每個標本檢測2次取平均值。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 肺組織病理學結果

2.1.1 大體觀察：對照組和免疫低下組肉眼觀察肺組織形態正常，表面光滑呈粉紅色，邊緣銳薄，觸之質地均勻無硬結。感染組肉眼觀察肺組織充血，表面可見凸凹不平，多個大小不一的灰白色病灶，質韌，第7天較第3天嚴重。

2.1.2 HE染色觀察：對照組和免疫功能低下組HE染色顯微鏡下見肺泡結構清晰完整，無炎性細胞浸潤，第3天和第7天肺組織沒有明顯的區別。感染組HE染色顯微鏡下見肺組織內多個壞死區域，界限欠清晰，病灶之間有融合，肺泡結構消失，肺泡腔及間質可見大量炎性細胞浸潤，第7天感染部位明顯增多（圖1～4）。

2.2 組織PAS染色結果

對照組和免疫低下組第3天和第7天肺組織內均未觀察到念珠菌孢子和菌絲；感染組第3天和第7天肺組織內可見大量念珠菌孢子（圖5）。

2.3 3組肺組織TLR2蛋白表達及比較

感染組第3天：肺組織TLR2蛋白表達的IOD值與其他兩組比較明顯增高，差異具有統計學意義，免疫低下組肺組織TLR2蛋白表達的IOD值與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。感染組第7天：肺組織TLR2蛋白表達的IOD值與其他兩組比較顯著增高，差異具有統計學意義（P＜0.05），免疫低下組肺組織TLR2蛋白表達的IOD值與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組、免疫低下組第3天與第7天組內比較均差異無統計學意義（P＞0.05）；感染組第7天TLR2表達與第3天比較差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。3組不同時間肺組織TLR2蛋白表達的免疫組織化學染色結果：TLR2的表達以細胞膜或細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性，對照組和免疫功能低下組大鼠肺巨噬細胞、支氣管上皮細胞和少量肺泡間隔細胞胞質有TLR2輕度表達，呈棕黃或淺黃細線型染色，局灶性散在分布。感染組肺組織內棕褐色顆粒明顯增加（圖6～9）。

2.4 3組肺組織勻漿上清液IL-10水平變化和比較

感染后3 d免疫低下組IL-10水平升高，與對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），感染組IL-10水平顯著升高，與免疫低下組和對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。感染后7 d免疫低下組和感染組IL-10水平顯著升高與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.05），感染組IL-10水平顯著升高與免疫低下組和對照組差異均有統計學意義（P＜0.05）。各組前后比較可見：對照組IL-10水平7 d和3 d比較差異無統計學意義（P＞0.05）。免疫低下組IL-10水平7 d較3 d增高（P＜0.05）。感染組IL-10水平7 d較3 d增高（P＜0.05）。見表2。

2.5 相關關系分析

肺組織TLR2與IL-10之間未見到有統計學意義的相關關系。

3 討論

肺念珠菌感染發生在免疫功能低下或妥協的宿主，患者一旦遭致支氣管肺部念珠菌感染，不僅治療困難、死亡率也很高。先天免疫作為免疫應答的始動環節，在抵御念珠菌感染中起到非常重要的作用，構成防御真菌感染的第一道防線，而且通過信號傳遞啟動后天獲得性免疫應答。

Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是重要的先天免疫的病原模式識別受體（Pattern recognition receptors，PPRs），可識別多種病原體相關分子模式（Pathogen-associated molecular pattern，PAMP），在介導抗真菌感染中發揮重要作用［8］。TLRs家族中目前被確認的成員有13個，已有研究證實TLR2在念珠菌感染的發病過程中起到一定的作用［9］。念珠菌細胞壁的殼素、葡聚糖、甘露聚糖、甘露蛋白族以及糖脂類等均可作為PAMP被巨噬細胞或樹突狀細胞等表面的TLRs識別，TLRs通過識別不同的念珠菌相關分子模式在抗念珠菌感染免疫中發揮不同的作用。

TLR2主要識別念珠菌細胞壁的甘露聚糖，通過跨膜結構將信號轉入細胞內，經由髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor 88，MyD88）依賴信號傳導途徑和MyD88非依賴信號轉導途徑產生復雜的級聯信號反應導致核因子κB（nuclear factorκB，NF-κB）等轉錄因子活化，介導細胞因子的分泌，參與免疫調節和誘導后天免疫功能的啟動［10］。有研究表明TLR2的高表達可以促進和加重白念珠菌的感染，TLR2基因缺陷鼠具有抵御白念珠菌感染的發生和播散的特征［1］。

本研究結果顯示，免疫功能低下大鼠支氣管肺感染念珠菌后的第3天，肺組織炎癥明顯，并隨著感染時間的延長（感染的第7天）炎癥程度也在加重；同時觀察在感染的第3天和第7天，肺組織的TLR2表達顯著增高。本研究結果提示支氣管肺念珠菌感染時，TLR2呈現高表達現象，推測TLR2的高表達在引起念珠菌感染和加重炎性反應中起到重要的作用。

有研究證實TLR2在念珠菌感染時的免疫調節作用與促進IL-10等細胞因子的分泌增多有關，研究顯示TLR2通過誘導IL-10的產生和CD4+CD25+調整 T 細胞（regulatory T cell，Treg）的增殖，抑制免疫調節，加重炎癥的發生和惡化［11］。TLR2基因缺陷鼠具有抵御白念珠菌感染的發生和播散，有研究認為TLR2基因缺陷后，致炎因子IL-10分泌明顯受到抑制和Treg活性明顯降低，結果吞噬細胞的趨化作用明顯增強，加速到達感染部位殺滅病原菌，防止了念珠菌感染的發生和播散［10，12］。還有研究顯示TLR2 通過影響 T 輔助細胞1（T helper cell1，Th1）和T 輔助細胞2（T helper cell1，Th2）的平衡，引起 INF-γ分泌的降低，IL-10分泌的相對升高，來抑制免疫反應，使感染加重［10］。并且發現TLR2可以識別念珠菌菌絲，誘導IL-10分泌，抑制免疫反應，使念珠菌逃逸免疫殺傷和引發炎性反應，是導致念珠菌感染發生的機制之一。

本研究不同于以往的細胞水平研究，在大鼠體內同時檢測了肺組織TLR2和IL-10水平，感染后TLR2表達升高，IL-10在感染的第3天明顯升高，感染的第7天繼續升高，提示TLR2和IL-10高表達可能在念珠菌感染的炎性反應中發揮重要作用。但是本研究統計學分析并沒有見到肺組織TLR2與肺組織IL-10之間有統計學相關關系。推測在白念珠菌感染時，IL-10的升高很可能還存在TLR2以外的因素所參與。有研究表明樹突狀細胞表面TLR2表達量上調可以使樹突狀細胞分泌大量的IL-10等細胞因子，表現出對真菌感染的易感性。TLR2敲除鼠對真菌感染表現出一定的抵抗性，其體內IL-10分泌也很少，由此推測TLR2介導的IL-10分泌量增加是宿主對真菌易感的重要因素［13］。研究發現IL-10的升高，可以阻止巨噬細胞活化，使念珠菌長期滯留，病情難以控制。白色念珠菌感染的嚴重程度與體內IL-10水平密切相關，在白色念珠菌感染中起負性調節作用，IL-10水平越高，感染程度越嚴重。到病原微生物感染時，IL-10呈高水平表達，既削弱機體的防御功能，限制機體過度異常的免疫反應，結果使感染向慢性轉化。利用IL-10拮抗劑對治療有一定的療效。

［1］Gankovskaia OA，Zverev VV，Lavrov VF，et al.Changes of expression levels of innate immunity signaling receptors during Candida albicans infections in vitro and in vivo［J］.Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol，2009（3）：60-63.

［2］Villamon E，Gozaibo D，Roig P.et al.Toll-like receptor2is dispensable for acquired host immune resistance to Candida albicans in a murinemodel of disseminated candidiasis［J］.Microbes Infect，2004，6（6）；542-548.

［3］Netea MG，Van der Meer JW，Kullberg BJ.Toll-like receptors as an escape mechanism from the host defense［J］.Trends Microbiol，2004，12（11）：484-488.

［4］Netea MG，Sutmuller R，Hermann C，et al.Toll-like receptor2suppresses immunity against Candida albicans through induction of IL-10and regulatoryTcells［J］.Immunology，2004，172（6），3712-3718.

［5］Selsted ME，Szklarek D，Ganz T，et al.Activity of rabbit leukocyte peptidesagainstCandidaalbicans［J］.InfectImmun，1985，49（1）：202-206.

［6］馬壯，錢桂生，黃桂君，等.免疫功能低下Wistar大鼠白念珠菌肺炎模型的建立［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2001，21（5）：569-573.

［7］Lewis RE，Lund BC，Klepser ME，et al.Assessment of antifungal activities of fluconazole and amphotericin B administered alone and incombination against Candida albicans by using a dynamic in vitro mycotic infection model［J］.Antimi Age Chemo，1998，42（6）：1382-1386.

［8］Tessarolli V，Gasparoto TH，Lima HR，et al.Absence of TLR2 influences survival of neutrophils after infection with Candida albicans［J］.Med Mycol，2010，48（1）：129-140.

［9］Yá觡ez A，Flores A，Murciano C，Signalling through TLR2/MyD88 induces differentiation of murine bone marrow stem and progenitor cells to functional phagocytes in response to Candida albicans［J］.Cell Microbiol，2010，12（1）：114-128.

［10］Burger-Kentischer A，Abele IS，Finkelmeier D.A new cell-based innate immune receptor assay for the examination of receptor activity，ligand specificity，signalling pathways and the detection of pyrogens［J］.Immunol Methods.2010，358（1-2）：93-103.

［11］Sutmuller RP，den Brok MH，Kramer M，et al.Toll-like receptor2controls expansion and function of regulatory T cells［J］.Clin Invest，2006，116（2）：485-494.

［12］Loures FV，Pina A，Felonato M，et al.TLR2 is a negative regulator of Th17 cells and tissue pathology in a pulmonary model of fungal infection［J］.Immunology，2009，183（2）：1279-1290.

［13］Ferreira KS，Bastos KR，Russo M，et al.Interaction between Paracocciioides brasiliensis and Pulmonary Dendritic Cells induces Interleukin-10 production and Toll-like receptor-2 expression：possiblemechanismsofsusceptibility［J］.Infect Dis，2007，196（7）：1108-1115.