PARP－1基因多態性與臨夏回族自治州回族人群胃癌易感性的關聯研究

唐小凡 何正德 李玉民 蔣祥林

幽門螺旋桿菌 (H．pylori)感染、鹽腌食品、飲酒、吸煙等是與胃癌發生有關的主要危險因素。然而，接觸同樣的危險因素，卻僅有部分人發生胃癌，說明不同個體對胃癌的易感性存在差異，其遺傳學基礎是人類基因組DNA序列的變異性，其中最常見的是單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)［1，2］。

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly(ADP ribose)polymerase，PARP］是一個能選擇性識別并結合DNA缺口的DNA結合蛋白酶，人的PARP組成一個有17個成員的大家族，其中PARP－1是原型。PARP－1基因存在多個單核苷酸多態性位點，其中某些位點被報道與惡性腫瘤的易感性相關［3］。

回族是我國的一個重要的民族。根據2000年第5次人口普查數據，甘肅回族人口為118．49萬人，居全國第二。甘肅臨夏回族自治州是全國兩個回族自治州之一。回族在臨夏州境內的總人口約61萬人。王德增等［4］發現回族胃癌患病率可能較高。其原因可能與遺傳及回族大部居住高原和飲食特點(冬春季節較長，多以腌菜為主)有關。蘇芳賢等［5］在3269例回族胃鏡檢查中，檢出胃癌431例，胃癌檢出率為13．2%。因此，探討回族胃癌發病機制、易感因素、治療方法及預防措施具有重要的意義。唐小凡等［6］研究表明COX－2－765G＞C和中國甘肅地區回族人群胃癌易感性增高相關。目前尚未見 PARP－1Val762Ala基因多態性與回族人群胃癌易感性方面的文獻報告。本研究旨在探討臨夏回族自治州回族人群中PARP－1基因多態與胃癌易感性之間關系。

資料與方法

1．一般資料:研究對象均為甘肅臨夏回族自治州居民(20歲以上，居住滿20年以上，3代無族外通婚的回族居民)。分胃癌組(200例)、正常對照組(210例)。胃癌組為2007年9月～2010年5月在甘肅臨夏及蘭州地區二級甲等以上醫院住院或接受胃鏡檢查并滿足上述條件的回族居民，均經組織病理學確診。正常對照組:來自同一時期該地區按性別、年齡(±5歲)配對，并排除腫瘤和消化系統疾病的健康回族志愿者。征得研究對象同意，并采集以下信息:a．人口學特征，如年齡、性別等;b．胃癌家族史(家族中有1名以上一級親屬或2名以上二級親屬患有胃癌者為陽性);c．食腌菜史(自行擬定標準為每周≥5次，每次≥50g，≥6個月/年，連續3年以上)。經調查，回族不吸煙、不喝酒，所以本研究未涉及吸煙、飲酒史。每位研究對象自愿貢獻外周靜脈血5ml(EDTA抗凝)，－70℃冰箱保存。

2．實驗方法:研究對象的基因組DNA樣品從外周血淋巴細胞中分離。使用幽門螺桿菌IgG酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測是否有H．pylori感染。擴增引物參照文獻，上游引物:5'－GCCCTCTGACATGTTTCTCC－3'，下游引物5'－AAGGAGGGCACCGAACAC －3'，由 Sangon公司合成(PAGE純化)［7］。PCR擴增在50μl反應體系中進行，包括10× Buffer5μl，4 × dNTPs 10mmol/L 5μl，25mmol/L MgCl26μl，引物(50μmol/L)各 1μl，Tag 酶 0．2μl，模板 3μl，去離子水 29μl。反應條件:94℃ 預變性 5min，然后按 94 ℃30s、62℃30s、72℃45秒的順序進行35個循環，最后72℃延伸10min。擴增產物用內切酶Tail進行消化，酶切反應體系為20μl，其中PCR產物10μl，2 ×Buffer2μl，內切酶1μl(10 個單位)，去離子水 7μl。37℃溫育過夜。3%瓊脂糖凝膠100V電泳檢測酶切結果。酶切后Ala/Ala型無酶切位點，產生100bp一條片段;Val/Val型產生80bp和20bp兩條片段;Val/Ala型經酶切后產生100bp、80bp和20bp 3條片段。其中20bp的片段與引物二聚體在凝膠上難以分辨。

3．統計學方法:兩組之間年齡性別差異用t檢驗比較。χ2檢驗比較兩組之間性別、家族史、食腌菜、H．pylori感染和各基以非條件Logistic回歸計算比值比(odds ratio，OR)及其95%可信區間(confidence interval，CI)評價各基因型與胃癌發病風險的關系。所用統計學分析軟件為SPSS 13．0。所有統計檢驗均為雙側概率檢驗。檢驗水準α=0．05。p＜0．05為差異具有顯著性。

結 果

1．胃癌組與正常對照組在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比較:胃癌組與正常對照組比較，家族史陽性率、食腌菜、H．pylori感染率均有統計學差異(P=0．000)(表 1)。

表1 胃癌組與正常對照組在家族史、食腌菜、H．pylori感染率方面的比較［n(%)］

2．基因型頻率分布及與胃癌的關系:表2所示PARP－1 Val762Ala的基因型頻率分布均符合Hardy－Weinberg平衡規律(P=0．348，0．067)。PARP －1 762Val/Ala、Ala/Ala分別與Val/Val比較，兩組之間差異無統計學意義(P＞0．05)，但Val/Ala+Ala/Ala在胃癌組顯著增高(P=0．020)。

3．基因型的分層分析:表3示:在年齡、性別、家族史、食腌菜分層分析中未觀察到基因型分布差異。在H．pylori感染陽性人群中，PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風險是Val/Val基因型的1.748 倍(OR=1．748，95%CI:1．016 ～ 3．008，P=0.043)。

表2 PARP－1基因型在3組中的分布及其與胃癌的關系［n(%)］

表3 PARP－1Val762Ala基因多態性與胃癌相關性的分層分析

4．家族史、食腌菜、H．pylori感染與 PARP－1 Val762Ala交互作用對胃癌發病風險的影響:分別以家族史陰性、不食腌菜、H．pylori感染陰性的正常對照組中基因型為Val/Val的個體為對照，家族史陽性的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風險是家族史陰性的正常對照組Val/Val基因型的4.125倍(OR=4．125，95%CI:2．117 ～8．038，P=0．000)，大于家族史陰性的胃癌組對家族史陰性的正常對照組OR值與家族史陽性的胃癌組對家族史陽性的正常對照組OR值乘積;食腌菜的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風險是不食腌菜的正常對照組 Val/Val基因型的 3．814 倍(OR=3．814，95%CI:2.150 ～6．766，P=0．000)，大于不食腌菜的胃癌組對不食腌菜的正常對照組OR值與食腌菜的胃癌組對食腌菜的正常對照組OR值乘積;H．pylori感染陽性的胃癌組Val/Ala+Ala/Ala基因型患胃癌的風險是H．pylori感染陰性的正常對照組Val/Val基因型的4．085 倍(OR=4．085，95%CI:2．197 ～ 7．597，P=0.000)，大于 H．pylori感染陰性胃癌組對 H．pylori感染陰性的正常對照組的OR值與H．pylori感染陽性的胃癌組對H．pylori感染陽性的正常對照組的OR值乘積，可見Val/Ala+Ala/Ala基因型分別與家族史、食腌菜、H．pylori感染對胃癌的發生具有加乘交互作用。

討 論

1．PARP－1 Val762Ala基因多態性與胃癌易感性:PARP－1主要通過修復DNA單鏈及雙鏈斷裂在維持基因組的完整性方面發揮作用［8］。PARP－1基因存在著豐富的單核苷酸多態性，尤其是Val762Ala位點的多態可下調酶的活性，與人類多種腫瘤相關［9］。Shiokawa 等［10］在人類生殖腫瘤細胞中發現了PARP－1 Val762Ala的基因多態性。Zhang等［11］的研究顯示在中國漢族人群中，PARP－1 Val762Ala多態與吸煙相關的肺癌發病風險增高相關。本研究發現攜帶PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型的個體患胃癌的風險是Val/Val攜帶者的2.158倍(P=0．020)。胃癌組的Ala等位基因頻率明顯高于正常對照組的Ala等位基因頻率(P=0．000)。通過數據分析，我們認為PARP－1 Val762Ala多態性與臨夏回族自治州回族胃癌的發病風險相關。

2．胃癌家族史、食腌菜、H．pylori感染與 PARP－1 Val762Ala的交互作用對胃癌發病風險的影響:胃癌有明顯的家族聚集現象，家族發病率高于人群2～3倍［12，13］。一般認為遺傳素質使致癌物質對易感者更易致癌，人體對內外源性致癌劑的代謝能力和基因修復能力等因素將影響個體對胃癌的易感性。本研究發現胃癌組的家族史陽性率高于正常對照組(P=0．000)。交互作用分析證明 PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型與家族史對胃癌的發生具有加乘交互作用。

李玉民等［14］研究發現腌菜中亞硝基化合物含量較高，經常食用腌菜人群的胃液中的硝酸鹽和亞硝酸鹽含量均明顯高于不常食用者。硝酸鹽和亞硝酸鹽可在胃內經細菌作用形成直接致癌的亞硝酰胺，它可以與DNA高分子結合導致基因突變。張龍杰等［15］研究表明腌菜有致癌作用，因為該類食物中含有大量的亞硝酸鹽，在胃中可轉化為強致癌化合物。本研究發現在胃癌組食腌菜的比例(42．0%)明顯高于正常對照組(21．4%)。交互作用分析發現PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala與食腌菜對于胃癌的發生具有加乘交互作用。

H．pylori是引發胃癌的主要因素之一。1994年國際癌癥研究中心將H．pylori列為Ⅰ類致癌因子。H．pylori在世界范圍感染率高達50%左右，我國不同地區、不同民族人群胃內H．pylori檢出率為30% ～80%。H．pylori感染可能引起胃黏膜上皮細胞增殖動力學的改變，產生致癌物及毒素，甚至引起基因及其表達異常。Zhang等研究發現H．pylori感染中的Cag(+)與PARP－1762Ala/Ala基因型共同促進了胃癌的發生和發展。PARP－1的Val762Ala的基因變異可導致PARP－1酶活性下降，修復DNA損傷的能力降低。本研究發現PARP－1 Val/Ala+Ala/Ala基因型與H．pylori感染對胃癌的發生具有加乘交互作用。

由于涉及癌變過程的基因－基因、基因－環境因素相互作用關系錯綜復雜，因此，本研究所獲得的這一結果有待于進一步擴大研究因素進行深入研究和探討。

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