蛋白質組學及相關技術在多囊卵巢綜合征中的應用

張勝坤 呂杰強 程 靜

多囊卵巢綜合征(polycystic ovary syndrome，PCOS)是一種多病因的、涉及多系統的疾病。蛋白質組學及相關技術的不斷發展，為對PCOS進行深入研究提供了新的途徑和思路。本文就蛋白質組學及相關技術以及在PCOS中的應用進行綜述。

一、蛋白質組學及相關技術

從基因水平上并不能闡明疾病的動態變化，蛋白質組學就應運而生。它以生物體內的全部蛋白質作為研究對象，可以全面的、動態的掌握生物體內不斷變化的蛋白質成分及功能狀態。目前蛋白質組學研究技術主要有凝膠電泳和質譜技術。二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(two－dimensional polyacrylamide gel electrophoresis，2D－PAGE)以電荷的差異、蛋白質分子質量的不同為基礎，經過蛋白樣品的變性、等電聚焦分離等步驟，膠條上會出現不同蛋白質條帶。再將膠條放在含十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠上，由于其相對分子質量不同而分離。分離后的蛋白質條帶通過差減處理，便可展示出不同蛋白樣品之間的差異。2D－PAGE只是一種重要的描述性技術，分離出來的蛋白質缺少必要的鑒定工具時，在蛋白質研究中的應用就會受到限制。基質輔助的激光解析電離化飛行時間質譜(matrix－assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF －MS)技術出現在20世紀70年代，它是將樣品和小分子的基質混合在一塊，并且基質包圍在樣品周圍。這樣再經過激光脈沖輻射，被結合的蛋白質就解析形成荷電離子。因為質荷比不同，這些離子在真空場中飛行的時間長短不一樣，從而繪制出質譜圖。20世紀90年代初期，Hutchens等［1］提出表面增強激光解析電離化飛行時間質譜技術(surface－enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry technology，SELDI－TOF－MS)，蛋白質分離技術又上了新的臺階，這一技術應用了獨特的蛋白質芯片系統，使得它可以更廣泛的應用在疾病發生機制的研究上，特別是在惡性腫瘤上應用方面。已有不少學者應用SELDI等技術來研究前列腺癌、卵巢癌、直腸癌、肺癌的診斷，并篩選腫瘤標志物［2～5］。近些年來，越來越多的研究者應用質譜技術來研究非惡性腫瘤，Wang等［6］2007年首次將SELDI技術應用于子宮內膜異位癥的研究，建立了子宮內膜異位癥的血清學診斷模型，子宮內膜異位癥的在位內膜的診斷模型和子宮內膜異位癥的腹腔積液診斷模型。

二、多囊卵巢綜合征

PCOS是一種遺傳異質性內分泌疾病，稀發排卵或無排卵(anovulation)、高雄激素血癥(hyperandrogenism)、肥胖及胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是其特征。育齡期婦女PCOS發病率為5% ～10% ，是引起無排卵性不孕的主要原因。其發病機制涉及內分泌、代謝、遺傳因素和胚胎發育等，還受環境因素的影響。PCOS的診斷一般采用2003年歐洲人類生殖和胚胎與美國生殖醫學會的(ESHRE/ASRM)鹿特丹專家會議推薦的標準:①稀發排卵或無排卵;②高雄激素的臨床表現和(或)高雄激素血癥;③超聲表現為多囊卵巢［一側或雙側卵巢有12個以上直徑為2～9mm的卵泡，和(或)卵巢體積＞10ml］;④上述3條中符合2條，并排除其他高雄疾病如先天性腎上腺皮質增生(CAH)、庫興綜合征、分泌雄激素的腫瘤。但美國雄激素過多協會(AES)也提出了自己的標準。近年來，對多囊卵巢綜合征的研究有很大進展，Dunaif等［7］發現胰島素抵抗是很多 PCOS發病的中心環節，也有學者研究稱瘦素和抑制素在多囊卵巢綜合征的發生發展中起到了很重要的作用［8，9］。雖然如此，PCOS仍面臨很多的挑戰，不僅其具體發病機制還不清楚，而且在臨床上還面臨很多的困惑:①至今PCOS還沒有一個很完美的診斷標準;②多毛的診斷及超聲對多囊卵巢的判斷帶有很大的主觀性;③PCOS病人常常有高雄激素的生化證據，但健康婦女與PCOS病人的生化數值有明顯的重疊;④不是所有的PCOS的婦女都會出現月經稀發或者閉經的原因尚不明確;⑤PCOS病人，對其長期并發癥如2型糖尿病、子宮內膜癌及心血管疾病的發病還缺乏有效的預測。

三、蛋白質組學在多囊卵巢綜合征中的應用

由于蛋白質組學技術的獨特優勢，為上述挑戰和困惑的解決帶來機遇。最近幾年，國內外不少學者應用其來研究多囊卵巢綜合征。研究材料包括卵巢組織、血清、外周血T淋巴細胞、卵泡液、網膜組織、卵巢顆粒細胞［10～14］。這些研究發現:PCOS婦女與正常婦女相比，表達出很多差異蛋白。研究者查詢相應生物信息庫發現:這些差異蛋白涉及纖溶系統、血栓形成、細胞周期調節、細胞凋亡、細胞復制、呼吸和細胞代謝、細胞信號、免疫系統、炎癥反應、代謝、氧化應激、胰島素抵抗、脂肪代謝、膽固醇及細胞骨架等。

傳統的研究方法已經表明多囊卵巢綜合征發病機制與胰島素抵抗、纖溶系統、血栓形成、脂肪代謝和凋亡等有關，而上述應用蛋白質組學的研究方法一方面證明了以前的研究，同時也發現了一些新的可能機制，如抗氧化途徑、免疫反應等。

抗氧化途徑:有3個研究涉及抗氧化通路［12，13］，這些抗氧化因子是過氧化物酶基因－1(peroxidase gene－1)、過氧化物酶基因 －2異構體(peroxidase gene－2 isoform)，谷胱甘肽 S轉移酶 M3(glutathiones transferase，GSTM3)，熱休克蛋白 27(heat shock protein27，HSP27)。過氧化物酶基因－1是一種抗氧化酶，參與控制細胞內的氧化還原反應。在Borro等［12］的研究中，PCOS婦女的T淋巴細胞中過氧化物酶基因－1是上調的，這表明氧化應激參與了PCOS的發生發展。過氧化物酶基因－2異構體具有抗氧化活性，在PCOS婦女網膜組織中的表達下降，這使得過氧化氫濃度增高，考慮到過氧氫具有引起的DNA破壞的作用，這或許可以部分解釋多囊卵巢患者容易發展成子宮內膜癌的原因。與過氧化物酶基因－2異構體表達下降相反，GSTM3的表達卻是增高的，GSTM3也是一種抗氧化酶，在細胞中，不僅參與細胞毒性物質的降解，而且還與白三烯、前列腺素、睪酮及孕酮的合成有關。另外，在脂肪細胞的過氧化中可以通過解毒作用起到保護細胞的作用。HSP27可以抑制活性氧的產生，它在PCOS婦女的卵巢中是減少的［10］。我國學者秦芬等在利用質譜技術研究PCOS時也有類似發現:HSP70在PCOS婦女血清中的表達下降。

最近的研究還發現參與免疫、炎癥反應的某些因子在PCOS婦女身上也發生了變化。諾丁漢大學Matharoo－Ball等，利用一種新型反相固相提取技術結合聚丙烯酰胺凝膠電泳并借助雙相凝膠電泳、MALDI－TOF－MS等蛋白質組平臺及人工神經網絡來研究PCOS病人，發現補體C4a3c鏈、C4鏈 和觸珠蛋白的表達與正常婦女的表達不同。補體C4a3c鏈的表達是上升的，并且其后的Western blotting驗證了這一點。這表明，這3個胰蛋白酶片段可能屬于補體C4途徑，當然，這還需要更進一步驗證和研究。還有一些因子，如Raf激酶抑制蛋白、Rho鳥苷二磷酸鹽解離抑制因子－1、過氧化物酶基因－1、F－肌動蛋白α1亞基抗體、人肌動蛋白素－1、膜聯蛋白V也直接或間接與免疫及炎癥反應有關［12，14］。

蛋白質組學技術既可以應用于PCOS發病機制的研究，還可以用于篩選生物標志物，并應用這些標志物來診斷PCOS。喬杰等［11］以血清為標本，利用SELDI質譜技術，建立了有胰島素抵抗的PCOS婦女與正常婦女、無胰島素抵抗PCOS與正常婦女及有胰島素抵抗與無胰島素抵抗PCOS診斷模型來診斷PCOS。這些模型的精確性、特異性、敏感性和陽性預測值均在80% ～90%之間，其中有胰島素抵抗和無胰島素抵抗的PCOS婦女中存在19個差異蛋白，其中M/Z為6629d差別最明顯，僅這一差異蛋白用來區別有胰島素抵抗的病人與正常婦女，其精確性、特異性、敏感性和陽性預測值分別為63.33%、70.00%、56．67%、68．18%;Matharoo － Ball等的研究得出的結果也證實了質荷比(m/z)為8674、8668、1351、8727、8673、6871 的 6 個生物標志物用來區分PCOS婦女和正常婦女，其敏感性為90．4%，質荷比為2924、3025、1977的敏感性更是達到了100%。對這些質荷比值做進一步研究，理論上說會發現一種或數種因子可以有效的診斷PCOS，甚至可以代替目前主觀性很高的診斷標準。

四、問題及展望

近些年來，蛋白質組學及相關技術蓬勃發展，但作為新興的學科還面臨很多問題和挑戰。從技術本身上來說，SELDI或者MALDI可能存在假陽性的問題，也就是說發現的差異蛋白也許不是疾病本身造成的，而是受到了其他因素的影響。在臨床應用中也存在很多問題，例如在PCOS的研究應用中，技術方面不僅有雙向電泳凝膠技術，還有SELDI、MALDI質譜技術;研究的材料來更是包括血清、網膜組織、卵巢組織、外周血T淋巴細胞、卵泡液等，多種技術和多種組織缺乏統一的標準，也就缺乏強有力的說服力。另外，他們所研究對象數目比較少(實驗對象數目3～30個)，目前還缺乏大規模的研究數據。總體上蛋白質組學在PCOS中的研究還處在起步階段，但隨著生物信息學等相關技術的進步，蛋白質組學及相關技術將在PCOS中有更多的、更深入的應用。相信Atiomo等［10］關于建立PCOS專用蛋白質組學生物信息庫的設想也會實現。

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