輕度認知障礙及阿爾茨海默病與載脂蛋白E基因多態性的相關性

呂小榮 鐘 遠 (上海交通大學附屬第六人民醫院老年科，上海 200233)

攜帶ApoEε4基因在不同地域不同人群中均可增加阿爾茨海默病(AD)的發病風險〔1〕，并且使AD的發病年齡提前，但是攜帶ε2基因對AD是否有保護作用還存在爭議。輕度認知障礙(MCI)是介于老年人正常認知狀態與癡呆之間的一種認知受損狀態，每年有 16% ～17.2% 的 MCI病人進展為 AD〔2，3〕。ε4基因作為AD的危險因素，亦能增加MCI的發病風險，同時促進MCI認知功能惡化〔3〕。由于MCI患者的異質性，種族及環境因素的差異可能會影響研究結果。本研究同時比較ApoE基因多態性與MCI和AD的關系，分析ApoE在認知功能退化的各個階段的影響，以期綜合評價在中國人群中ApoE基因多態性與MCI和AD發病的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 來自2007～2010年上海市第六人民醫院老年科專家門診及住院部患者。AD組：采用美國國立精神病學、語言障礙和卒中-老年性癡呆和相關疾病學會(NINCDS-ADRDA)制定的“很有可能AD”診斷標準。所有患者無陽性家族史，并排除嚴重腦血管疾病、精神分裂癥、抑郁癥、癲癇、昏迷。AD組共100例，男56例，女44例;年齡66～89歲，平均(77.0±4.8)歲;簡易智能狀態檢查(MMSE)得分(16.9±5.8)。文盲和小學30例，中學39例，大學或更高31例。MCI組：入組標準參照1999年Peterson等提出的MCI診斷標準：①有記憶力減退主訴，且病程超過6個月;②沒有或很少伴有其他認知域損害;③臨床癡呆量表(CDR)評分為0.5;④MMSE評分24～27分;⑤日常生活活動量表(ADL)評分＜26分;⑥非癡呆。排除標準同AD組。MCI組共84例，男49例，女35例;年齡69～92歲，平均年齡(81.7±4.8)歲;MMSE得分(24.4±2.6)。文盲和小學7例，中學23例，大學或更高53例。正常對照組：均符合以下入組標準：①無記憶力減退主訴;②日常生活能力正常;③CDR=0分;④MMSE評分＞27分;⑤年齡、性別與MCI組、AD組相匹配。排除標準同AD組。其中男性60例，女性46例，平均年齡(79.5±5.0)歲，MMSE得分(28.7±1.4)。文盲和小學1例，中學12例，大學或更高88例。

1.2 DNA抽提 按常規方法提取外周血白細胞基因組DNA，純度達到1.8＜A280/A260＜1.9。

1.3 PCR擴增目的基因片段 引物設計參考文獻〔4〕，上游引物為5'-TAAGCTTGGCACGGCTGTCCAAGGA-3'，下游引物為5'-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGFACAC-3'。PCR反應體系為20 μl，含有 DNA 模板 200 ～ 300 ng，Taq 酶 1 U，DMSO 1 μl，dNTP 0.2 mmol/L，上下游引物 0.2 μmol/L，Mg2+1.5 mmol/L。反應條件：95℃變性 5 min，95℃變性 30 s，63℃退火 30 s，72℃延伸40 s，循環35次，72℃延伸10 min。用2%的瓊脂糖凝膠電泳PCR產物。

1.4 限制性片段長度多態性(RFLP)分析 取5 μl PCR產物，加 2 U HhaI內切酶，2 μl 10 × buffer，用水補足至20 μl，37℃酶切過夜。取5 μl酶切產物，采用12%非變性聚丙烯酰胺膠電泳，電壓150 V，電泳4 h。電泳結束后銀染，用超純水漂洗1 min，加銀染液0.1%AgNO3，置水平搖床10 min，純水漂洗1 min，加顯影液(1.2%NaOH，4%甲醛)顯影，條帶清晰時用乙酸終止反應。拍片，根據電泳條帶確定基因型。

1.5 統計學分析 使用SPSS 17.0統計分析數據，采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗，基因頻率和基因型的分布差異亦采用χ2檢驗分析。各組計量資料采用單因素方差分析進行分析。采用Logistic回歸校正年齡、性別等因素的影響，計算比值比(OR)及其95%CI。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗 除AD組外，正常對照組和MCI組ApoE基因型頻率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＜0.05)。

2.2 各組ApoE基因型及等位基因頻率 各組中ε3/ε3為最常見基因型，ε3為頻率最高等位基因，ε4次之，ε2最少。ε4基因頻率在正常對照組、MCI組和AD組中逐漸遞增。ε2基因在各組中的分布相似。組間比較基因型顯示MCI組與正常對照組的差異無統計學意義(P＞0.05)，AD組與MCI組、正常對照組差異均顯著(P＜0.05);三組基因型總體比較統計學差異顯著(P＜0.01)。等位基因組間兩兩比較差異均顯著(P＜0.05)，總體比較差異非常顯著(P＜0.01)。見表1。

表1 各組別ApoE基因型及等位基因分布〔n(%)〕

將基因型分為 ε2(+)基因型(包括 ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4)與 ε2(-)基因型(包括 ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4)，三組總體比較其差異無統計學差異(P＞0.05)，各組兩兩比較發現均無統計學差異(P＞0.05)。將基因型分為 ε4(+)基因型(包括 ε4/ε4、ε2/ε4、ε3/ε4)與 ε4(-)基因型(包括 ε2/ε2、ε2/ε3、ε3/ε3)，三組總體比較有顯著性差異(P＜0.01)，各組兩兩比較其差異均有統計學意義(P＜0.05)。ε4(+)基因型的頻率在正常對照組、MCI組、AD組中逐漸升高。

2.3 ApoE基因多態性對MCI和AD發病風險影響 采用Logistic回歸校正年齡、性別，分析表明ε4基因攜帶者患MCI的風險為非攜帶者的2.7倍(OR=2.7，95%CI=1.29～5.70)，患AD的風險為非攜帶者的3.7倍(OR=3.7，95%CI=1.89～7.38)。見表2。

表2 ApoEε4比值比

3 討論

目前ApoEε4基因是最重要的散發性AD易感基因，鑒于MCI向AD的高轉化率，ε4基因可能與MCI密切相關。在本研究中中國漢族人群ε4基因頻率為7.5%，與國內其他研究結果類似〔5，6〕，低于高加索人群的基因頻率 14%〔7〕，這可能是中國人群中AD發病率低于國外的原因。

本研究的結果表明ε4基因是MCI和AD共同的危險因素，這與其他AD或 MCI的研究報道想一致〔5，6〕。ApoE在腦中主要由星形膠質細胞產生，以膽固醇和脂質蛋白轉運的方式調節突出的重塑及細胞間的物質交換，并且ApoE對Aβ的聚集和清除有調節作用〔8〕。ApoE不同亞型對腦中脂質代謝調節存在差異，這可能是ε4基因增加MCI與AD發病風險的機制。

同時本研究中ε4基因對MCI和AD發病的影響存在差異，可能有以下原因。在臨床隨訪中，MCI患者除了進展為AD外，部分病人的認知功能不再繼續惡化甚至恢復〔9，10〕。在對MCI患者尸體解剖中發現部分MCI患者神經系統表現為AD的病理變化，其他MCI患者則表現為輕微血管損傷、海馬硬化和嗜銀顆粒〔11〕。因此MCI作為一種綜合征，雖與AD密切相關，但臨床預后與病理學變化較AD更具多樣性。Farlow等〔12〕對494例MCI患者的研究發現，ε4基因攜帶者海馬區體積更小，認知功能更差，病理變化與AD更相似。亦有研究證明MCI患者中ε4攜帶者轉化為AD的概率更高〔13〕。以上證據可說明ε4基因促使MCI患者進展為AD，并導致MCI向AD的高轉化率。因此MCI可能并非AD的獨立危險因素，兩者的遺傳學差異有待進一步的研究。

在各種研究報道中ε2基因對AD的作用并不一致，本研究中ε2基因對AD無保護作用，與臺灣的Lung等〔14〕研究相一致，而Wilson等〔15，16〕研究報道 ε2基因具有保護作用。分析上述結果的差異可能與種族有關，樣本的選擇可能也是一個重要因素。綜上所述在中國人群中認知功能障礙的各個階段，ε2基因均無保護作用。

總之，ε2基因對MCI和AD的發病風險無保護作用，ε4基因雖然是MCI和AD共同的危險因素，但對MCI和AD影響存在差異。ApoE基因多態性引起的脂代謝差異與MCI和AD神經系統的病理學變化之間的關系需要進一步的研究。

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