慢性腦缺血大鼠海馬區Cdc42表達及其與認知功能障礙的相關性

李 星 張博愛 姬亞杰 劉榮麗 賈 賀 張小敏 劉 宇

(鄭州大學第一附屬醫院神經內一科，河南 鄭州 450052)

慢性腦缺血可由于長期腦低灌注狀態而導致持久性和進展性的認知功能障礙。目前對于其發生發展的相關機制研究較少。Cdc42作為Rho家族的一員，是肌動蛋白細胞骨架的重要調節子。它作為細胞內“分子開關”在神經元的發生、存活、遷移、神經突起的生長和導向、突觸的形成和可塑性等方面均發揮重要的作用。實驗證明持久性雙側頸總動脈結扎(2VO)術后8～12 w為腦缺血的慢性期，腦低血流轉為慢性狀態，這一期與人類老齡化和阿爾茨海默病(AD)、血管性癡呆(VD)狀態形成之腦低灌注狀態極其相似〔1〕。本實驗探討慢性腦缺血所致認知功能障礙過程中Cdc42可能發生的作用及應答機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑 雄性SD大鼠＞12月齡(購自鄭州大學實驗動物中心);Cdc42羊多克隆抗體(sc-6083美國Santa Cruz公司);免疫組化試劑盒(PV-9003北京中杉金橋);DAB試劑盒(北京博奧森);組織裂解液(R0010北京索寶萊科技公司);Western二抗(北京中杉金橋);內參β-actin(TA-09北京中杉金橋);ECL試劑盒(Pierce)。

1.2 動物模型的制備及分組 缺血模型組參照Ni等〔2〕的制作方法制備2VO模型，10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，頸前部去毛消毒;沿頸正中切開皮膚，小心分離出雙側頸總動脈;分別結扎雙側頸總動脈的遠心端與近心端，從中間剪斷，以確保阻斷頸總動脈血流;縫合皮膚。術中大鼠肛溫保持在36.5～37.5℃。將造模成功大鼠分為2VO 8、10、12 w組。每組10只。假手術組除不結扎雙側頸總動脈外，余處理同模型組大鼠。

1.3 Morris水迷宮實驗 Morris水迷宮有圓形水池、自動攝像機及電腦分析系統組成。測試前將水注入池中，水深30 cm(即水面高出站臺表面1 cm，使大鼠不能見到站臺)，水溫控制在(26±1)℃。實驗在隔音、較暗的房間內進行，各種實驗條件保持不變。各組大鼠均在處死前5 d開始Morris水迷宮學習，選擇一個象限的固定位置將大鼠入水，以入水起至找到平臺的時間為逃避潛伏期，如在90 s內未找到平臺，用棒將其引上平臺，并讓其站立10 s，潛伏期記為90 s。每天訓練4次，上午2次，下午2次。第5天成績的平均值作為術前測試成績。數據采集及圖像分析均由圖像自動監視和處理系統完成。測試結束后即行手術取腦。

1.4 腦組織切片的制備及Cdc42蛋白的免疫組織化學檢測分別取假手術組大鼠以及術后8、10、12 w模型組大鼠，水合氯醛腹腔注射麻醉，250 ml生理鹽水(37℃)經心臟灌注快速沖洗血細胞，用4%多聚甲醛(4℃)250 ml灌注。直到大鼠全身僵硬為止，開顱取出全腦，去掉腦干和小腦，4%多聚甲醛固定8 h，石蠟包埋后，3 μm厚連續切片。選擇海馬區的腦片，經烤片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水、抗原熱修復，血清封閉液封閉，滴加Cdc42一抗(1∶70)4℃孵育過夜，試驗中選擇磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。然后參照二抗試劑盒(PV-9003)說明書操作，DAB顯色，于顯微鏡下控制反應時間，蘇木精復染，鹽酸酒精分化，樹脂封片。采用熒光倒置顯微鏡(德國 LEICA)，在400倍視野下觀察，計數5個不重復視野中的陽性細胞個數，取平均值。

1.5 蛋白樣品的制備及Cdc42蛋白的Western印跡檢測 分別取假手術組大鼠以及術后8、10、12 w模型組大鼠，水合氯醛腹腔麻醉后，迅速取腦，于冰上分離海馬。用生理鹽水沖洗后，迅速置于液氮罐中低溫保存。從液氮罐中取出海馬，置于勻漿器中，按照每100 mg組織加入1 ml裂解液的比例加入裂解液，于冰上研磨30 min，所得的裂解產物以4℃離心30 min，小心收集上清液。所得上清液加入上樣緩沖液后98℃變性5 min，根據蛋白定量或actin調整蛋白上樣量。后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠濃度4%，分離膠濃度12%，然后半干轉至PVDF膜上，電流為(0.8 mA/cm2)，脫脂奶粉封閉1 h，用1∶600的Cdc42一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次15 min;加二抗濃度1∶10 000，室溫孵育1.5 h，同上洗滌，內參β-actin一抗1∶1 000室溫孵育1.5 h，內參二抗1∶4 000室溫孵育1 h，ECL顯色，用X光片壓片并沖洗。掃描膠片上的條帶，以目的蛋白灰度值與內參actin灰度值比值進行統計分析。

1.6 統計學分析 首先進行數據的正態性檢驗和方差齊性檢驗，應用SPSS13.0軟件，組間比較采用單因素方差分析，用s表示。

2 結果

2.1 水迷宮測試結果 假手術組大鼠的逃避潛伏期為(32.50±9.70)s，缺血8、10、12 w 組的潛伏期分別為(51.00 ±11.16)、(63.50±14.11)、(77.90 ±8.41)s，各組間差異均有顯著統計學意義(P＜0.05)，說明隨著慢性腦缺血時間的延長，大鼠的學習記憶能力呈明顯下降趨勢。

2.2 免疫組化檢測結果 如圖1所示。海馬神經元胞質中均可見棕黃色顆粒，主要位于軸突和樹突中，說明均有Cdc42表達;缺血8 w組Cdc42表達的陽性細胞數較假手術組明顯減少，且隨缺血時間延長，陽性細胞個數進行性減少(P＜0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠海馬區Cdc42的免疫組化染色結果(DAB染色，×400)

2.3 Western印跡檢測結果 如圖2所示，各組均可見Cdc42表達，缺血8 w組Cdc42的表達較假手術組明顯降低，且隨缺血時間延長其表達量進行性減少(P＜0.05)。與免疫組化檢測結果一致。見表1。

表1 各組大鼠海馬區Cdc42表達的陽性細胞數及Western印跡相對灰度值( s，n=10)

表1 各組大鼠海馬區Cdc42表達的陽性細胞數及Western印跡相對灰度值( s，n=10)

與假手術組比較：1)P＜0.05，2)P＜0.01;與術后8 w組比較：3)P＜0.05，4)P ＜0.01;與術后10 w 組比較：5)P ＜0.05

組別 免疫組化陽性細胞數(個)Western印跡相對灰度值(%)74.00±7.30 73.20±6.33 2VO術后8 w組 66.40±7.521) 64.60±8.191)2VO術后10 w組 57.30±7.322)3) 56.20±7.432)3)2VO術后12 w組 48.90±8.322)4)5) 48.60±8.382)4)5)假手術組

圖2 各組大鼠海馬區Cdc42的Western印跡檢測結果

3 討論

中樞神經系統神經元的存活、再生、遷移、分化均需要細胞骨架的參與。包括肌動蛋白、肌球蛋白、微管蛋白之間的相互協調。Cdc42作為Rho家族中的重要一員，是肌動蛋白細胞骨架動力的重要調節子，且廣泛分布于中樞神經系統的成熟神經元中〔3〕。Cdc42信號途徑是經由胞外信號分子激活下游的一個Cdc42交換因子Intersectin，進而將Cdc42活化，同時活化一個接頭蛋白N-WASP。活化的Cdc42和N-WASP共同作用于肌動蛋白相關蛋白(Arp2/3)，從而激活Arp2/3介導的肌動蛋白聚合反應，引起細胞骨架的變化，產生偽足〔4〕。

慢性腦缺血后，腦組織產生一系列的損傷級聯反應導致海馬神經元進行性減少，組織學改變進行性加重〔5〕。而海馬是維持正常認知功能的重要環節。本實驗中水迷宮結果顯示缺血組大鼠的學習記憶功能較假手術組明顯降低。同時我們觀察到海馬中Cdc42表達量隨缺血時間延長減少;而實驗證明Cdc42可通過顯著的促進肌動蛋白的形成從而促進神經元的存活并促其再生〔6〕。提示有可能Cdc42促進肌球蛋白聚合以及肌動蛋白形成的能力隨表達量減少而減弱，維持細胞骨架正常形態的能力受損，導致海馬區的神經元的存活能力及功能下降，從而導致認知功能障礙的形成及加重。

Cdc42信號途徑還可以通過細胞骨架的重構促進神經元突起的形成、軸突樹突的生長和再生，調節樹突棘的密度、生長及維持，進而影響神經元的形態以及運動功能〔7〕。樹突棘作為突觸可塑性的重要組成部分顯著影響神經系統的學習、記憶、發育、損傷及修復等多種功能〔8〕。有研究證明激活狀態的Cdc42對于促進海馬神經元樹突棘的生長是極為重要的，負顯性的Cdc42則減少樹突棘的生長〔9〕。Cdc42表達量的減少還可以引起樹突棘密度的下降〔10〕。結合曾有研究表明在AD、VD等多種以慢性腦缺血為共同病理過程的疾病中均存在著樹突棘形態、數目、結構等的異常〔11〕。支持本實驗中Cdc42表達減少，可能通過降低樹突棘密度、抑制樹突棘生長而對缺血大鼠學習、記憶能力產生影響。

綜上所述，通過對慢性腦缺血大鼠認知功能以及海馬區Cdc42表達的研究，發現隨缺血時間延長，大鼠認知功能障礙逐漸加重，Cdc42表達量逐漸減少，推測Cdc42可能通過影響細胞骨架重構，引起海馬神經元以及樹突棘的存活及功能受損，從而在慢性腦缺血所致認知功能障礙中發揮重要作用，調控Cdc42的表達可能作為慢性腦缺血的新的研究以及治療靶點。

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5 Horvath S.The pathological and clinical consequences of chronic cerebral hypoperfusion〔J〕.Orv Hetil，2001;142(7)：323-9.

6 Kozma R，Sarner S，Ahmed S，et al.Rho family GTPases and neuronal growth cone remodelling：relationship between increased complexity induced by Cdc42Hs，Rac1，and acetylcholine and collapse induced by RhoA and lysophosphatidic acid〔J〕.Mol Cell Biol，1997;17(3)：1201-11.

7 Kuramoto K，Negishi M，Katoh H.Regulation of dendrite growth by the Cdc42 activator Zizimin1/Dock9 in hippocampal neurons〔J〕.J Neurosci Res，2009;87(8)：1794-805.

8 Negishi M，Katoh H.Rho family GTPases and dendrite plasticity〔J〕.Neuroscientist，2005;11(3)：187-91.

9 Yoon MS，Cho CH，Lee KS，et al.Binding of Cdc42 to phospholipase D1 is important in neurite outgrowth of neural stem cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006;347(3)：594-600.

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11 Huesa G，Baltrons MA，Gomez-Ramos P，et al.Altered distribution of RhoA in Alzheimer's disease and AbetaPP overexpressing mice〔J〕.J Alzheimers Dis，2010;19(1)：37-56.