重金屬鉛酶聯免疫檢測方法的研究

楊依錦 王俊平 王 津 方淑兵 王 碩

（1.食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學，天津 300457）

重金屬鉛酶聯免疫檢測方法的研究

楊依錦1，2王俊平1，2王 津1，2方淑兵1，2王 碩1，2

（1.食品營養與安全教育部重點實驗室，天津 300457；2.天津科技大學，天津 300457）

制備鉛離子多克隆抗體，并建立間接競爭ELISA檢測方法。利用雙功能螯合劑ITCBE將Pb2＋與載體蛋白KLH和BSA偶聯在一起，制備免疫抗原與檢測抗原；通過免疫新西蘭大耳白免成功制備鉛多克隆抗體，建立間接競爭ELISA檢測方法，并與ICP－MS檢測結果進行比較。標準曲線IC50為3.48ng／mL，IC15為0.32ng／mL，與ICP－MS法檢測結果的總符合率超過97%。

鉛；多克隆抗體；間接競爭ELISA

重金屬是一種常見的污染源，其中鉛的污染又尤為嚴重，對環境與人類造成了嚴重的危害。鉛的毒性很強，是重金屬污染中的“五毒”之一。它對人體的毒性作用包括神經毒性、腎臟毒性、造血系統毒性、心血管系統毒性、生殖系統毒性、關節毒性、內分泌系統毒性以及胃腸道和肝臟的毒性等，還會對兒童的生長發育產生影響［1－3］。

目前檢測鉛離子的主要方法有原子熒光光度法（AFS）、電感耦合等離子體質譜（ICP－MS）分析技術、電感耦合等離子原子發射光譜（ICP－AES）、高效液相色譜法（HPLC）等［4－8］，這些檢測方法所需的儀器較昂貴，操作復雜，需要專業的工作人員。重金屬免疫學檢測方法是通過制備重金屬的特異性抗體，利用抗原－抗體反應進行的快速、準確的檢測方法，與傳統檢測技術相比有著快速，簡單，價格低廉，適合現場監測等優點。本試驗擬建立重金屬鉛間接競爭酶聯免疫檢測方法，同時將其用于實際樣品添加回收的試驗。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

鉛溶液、鎘溶液、汞溶液、鐵溶液、鉻溶液、鎳溶液、銅溶液、鎂溶液、銀溶液、錳溶液：中國國家標準物質研究中心；

1－（4－異硫氰酸芐基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）：上海同仁化學研究所；

鑰孔血藍蛋白（KLH）、牛血清蛋白（BSA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、二甲基亞砜（DMSO）、N－（2－羥乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）：美國Sigma公司；

濃硝酸、高氯酸：優級純，天津市化學試劑一廠；

自來水、海河水：采自天津本地；

白芷：購自天津某藥房；

胡蘿卜、皮皮蝦：購自天津某超市。

1.1.2 儀器

酶標儀：Thermo 1500，美國Thermo公司；

蛋白純化儀：BioLogic LP，美國BIO－RAD公司；

電感耦合等離子體質譜儀（ICP－MS）：7500cx（G3272B），美國 Agilent公司；

高壓消解罐：LTG－PTFE，上海隆拓儀器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫原的制備 抗原采用雙功能螯合劑1－（4－異硫氰酸芐基）－乙二胺四乙酸（ITCBE）將重金屬鉛和鑰孔血藍蛋白（KLH）相連。取1.5mg ITCBE溶于1mL二甲基亞砜（DMSO）中，取標準硝酸鉛溶液（1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。將ITCBE緩慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺將pH調到中性，常溫反應過夜。取10mg KLH溶于pH 9.0的N－（2－羥乙基）哌嗪－N′－2－乙烷磺酸（HEPES）緩沖溶液中，將螯合好的Pb－ITCBE結合物緩慢滴加入蛋白溶液中，反應過程中，保持pH在8.0～9.0（用三乙胺調pH，使其值的穩定）。室溫反應過夜。反應完全后在10mmol／L的pH為7.4的HEPES緩沖溶液中進行透析，除去未反應的小分子。放入－20℃保存備用。

1.2.2 包被抗原的制備 包被原采用雙功能螯合劑ITCBE將重金屬鉛和牛血清蛋白（BSA）相連。取1.5mg ITCBE溶于500μL DMSO 中，取 標 準 硝 酸 鉛 溶 液 （1 000mg／L Pb2＋）0.7mL。將ITCBE緩慢滴加入Pb（NO3）2溶液中，用三乙胺將pH調到中性，常溫反應過夜。取10mg BSA溶于pH 9.0的 HEPES緩沖溶液中（2mL），將螯合好的Pb－ITCBE結合物緩慢滴加入蛋白溶液中，反應過程中，保持pH在8.0～9.0。室溫反應過夜。反應完全后在10mol／L的pH為7.4的HEPES緩沖溶液中進行透析，除去未反應的小分子。放入－20℃保存備用。

1.2.3 抗體的制備 將制備好的免疫原同時免疫兩只新西蘭大耳白兔，初次免疫時，需將免疫抗原與完全弗氏佐劑按1∶1的體積比制備成“油包水”的乳液狀，每只兔子的免疫劑量為1.0mg（用0.9%的生理鹽水將免疫抗原稀釋為1mg／mL的濃度）。第一次免疫時采取的是背部皮下多點注射和腿部肌肉注射。分別于初次免疫后2，4，8周加強免疫3次，每只兔子免疫劑量減半。在第3、4次免疫后的7～10d，進行耳靜脈采血測定抗血清效價和親和性，當抗血清效價與親和性不再增加時采用股動脈采血法取全血［9］。本試驗采用免疫親和層析法進行抗體純化，用Sepharose 4B－Protein A作親和層析介質純化抗血清，所得抗體用PBS透析后4℃保存備用。

1.2.4 重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法的建立

（1）包被抗原的包被：用包被液將包被原稀釋至1μg／mL，以100μg／孔的量包被在96孔酶標板上，4℃過夜孵育（12～16h），第2天將孔中液體棄去，然后用PBST溶液洗板3次。

（2）封閉：封閉液使用0.5%的脫脂乳粉溶液（200μg／孔），37℃恒溫烘箱孵育1h。棄去封閉液后用PBST溶液洗板3次。

（3）加樣：每孔先加入50μL螯合后的重金屬標準溶液或樣品提取液，然后加入50μL抗體稀釋液（用PBS緩沖液稀釋）。室溫下在搖床震蕩競爭反應1h，然后用PBST溶液洗板3次。

（4）加酶標二抗：加入用PBS稀釋至10 000倍的酶標二抗（100μg／孔），室溫孵育30min后，棄去二抗，然后用PBST溶液洗板3次。

（5）顯色：每孔中加入100μL的底物液（底物A與TMB的混合溶液），室溫下反應20min。

（6）終止：每孔中加入50μL的終止液（1.25M的濃硫酸），終止反應。

（7）讀取吸光度值：在雙波長方式（450～650nm）下用酶標儀讀取吸光度值（OD值）。

（8）抑制率的計算：按式（1）進行。

式中：

R—— 抑制率，%；

OD對照—— 不加標準品的吸光值，即只加抗體的吸光值；

OD空白——不加標準品和抗體的吸光值，即只加PBS的吸光值；

OD——加了抗體和不同濃度標準品混合物的吸光值。

以重金屬鉛的濃度取對數后為橫坐標，抑制率為縱坐標，繪制出重金屬鉛的標準曲線。

1.2.5 抗體特異性的測定 本試驗選擇了ITCBE螯合后的金屬汞（Hg）、鎘（Cd）、鉻（Cr）、銀（Ag）、錳（Mn）、鎳（Ni）、銅（Cu）、鎂（Mg）、鐵（Fe）及單獨的螯合劑ITCBE進行交叉反應的測定，計算出各個競爭物的IC50值，得出它們與重金屬鉛（Pb）抗體的交叉反應率，以此判斷抗體的特異性。

交叉反應率的計算：按式（2）進行。

式中：

CR—— 交叉反應率，%；

IC50對照——其他重金屬螯合后所測得的IC50值；

IC50測定——重金屬鉛螯合后所測得的IC50值。

1.2.6 樣品處理及基質影響的消除

（1）自來水樣和海河水樣：自來水經PBS緩沖液稀釋5倍后，可消除基質影響；海河水需過0.22μm的水膜后，再用PBS緩沖液稀釋8倍，可消除基質影響。

（2）其他樣品（中藥白芷、胡蘿卜、皮皮蝦）：將樣品烘干后，粉碎成粉末，稱取1g，使用強酸（濃硝酸10mL，高氯酸5mL）浸泡12h，第2天在高溫（160～180℃）下硝化至溶液澄清，選用Tris－HCl將pH調至中性，然后過0.22μm的水膜，用雙蒸水定容稀釋60倍，可消除基質影響。

1.2.7 樣品添加回收 每100mL自來水樣品中分別添加濃度為1mg／mL的重金屬Pb標準溶液0.2，2，6.5μL，最終添加的量分別為0.2，2，6.5μg，添加完后，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進行螯合，經PBS緩沖液稀釋5倍后，然后進行ic－ELISA測定；每100mL海河水樣品中分別添加濃度為1mg／mL重金屬Pb標準溶液0.32，3.2，10.4μL，最終添加的量分別為0.32，3.2，10.4μg，添加完后，需過0.22μm的水膜，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進行螯合后，再用PBS緩沖液稀釋8倍，然后進行ic－ELISA測定；其他基質樣品處理為粉末后向其中每1g樣品中分別添加濃度為1mg／mL的重金屬 Pb標準溶液0.024，0.24，0.78μL，最終添加的量分別為0.024，0.240，0.78μg，之后按1.2.6所述方法進行硝化后，與螯合劑ITCBE按摩爾比1∶1的比例進行螯合，稀釋后進行ic－ELISA測試，上述每個添加濃度都做3個平行試驗。

回收率按式（3）計算：

式中：

Re—— 回收率，%；

C測定—— 實際測出的濃度；

C空白——未添加標品所測出的濃度；

C添加—— 實際添加的濃度。

1.2.8 儀器驗證 本試驗采用電感耦合等離子體質譜（ICP－MS）對建立的方法進行驗證。按照步驟1.2.7的方法對基質進行添加后，同時用建立的ic－ELISA方法和ICPMS方法進行檢測，并進行相關性分析。

2 結果與討論

2.1 建立的ic－ELISA方法的標準曲線的繪制

在建立的間接競爭ELISA方法下，將螯合后的Pb標品從200ng／mL開始5倍梯度稀釋，稀釋6個濃度，得到不同濃度Pb標品的OD值，根據式（1）計算抑制率，從而繪制標準曲線。

圖1 重金屬鉛ic－ELISA檢測的標準曲線Figure 1 Standard curve of lead on ic－ELISA

由圖1可知，靈敏度IC50為（3.48±0.09）ng／mL，最低檢出限IC15為（0.32±0.02）ng／mL。

2.2 抗體特異性

本試驗中交叉反應結果見表1。

表1 重金屬鉛的交叉反應Table 1 Cross－reactivity of lead

由表1可知，該抗體與其他金屬和螯合劑ITCBE的親和性較低，對重金屬鉛有較高的特異性。

2.3 樣品處理與基質消除

根據1.2.6所述，處理樣品后，所得到的基質曲線與標準曲線見圖2。

一般認為相同濃度下標準曲線的抑制率與基質曲線的抑制率相差小于20%就可認定為基質影響基本消除。由圖2可知，經過處理后的基質曲線與標準曲線基本重合，說明基質影響已消除。

2.4 回收率

由表2可知，對于自來水、海河水、中藥白芷、胡蘿卜、皮皮蝦基質的回收率都在78.5%～121%，表明建立的間接ELISA檢測法符合準確度的要求。

2.5 儀器驗證

本試驗建立的間接競爭ELISA方法與ICP－MS檢測法的相關性試驗結果見圖3。由圖3可知，兩種方法檢測結果一致性較高，線性相關系數R2＝0.976。結果充分表明了本試驗建立的重金屬鉛間接ELISA檢測方法結果的準確性，并且試驗結果穩定可靠。

圖2 基質影響的消除Figure 2 Eliminate of the matrix influence（ n＝3）

表2 重金屬鉛ic－ELISA檢測法添加回收率表Table 2 Recovery studies of lead at three levels by ic－ELISA

圖3 ic－ELISA和ICP－MS測定結果相關性曲線Figure 3 Correlations between ic－ELISA and ICP－MS results

3 結論

本試驗采用雙功能螯合劑ITCBE使得重金屬鉛與蛋白相連制備成免疫原后，成功獲得高特異性的重金屬鉛多克隆抗體。建立的重金屬鉛間接競爭酶聯免疫檢測方法的靈敏度為IC50＝（3.48±0.09）ng／mL，最低檢出限為IC15＝（0.32±0.02）ng／mL，線性范圍為0.32～53.49ng／mL（此處以抑制率15%～90%為線性范圍），相關系數R2值為0.999。

以ICP－MS檢測方法為標準，對建立的重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法的準確性進行了驗證，線性相關系數R2值為0.976，結果證明了建立的重金屬鉛間接競爭ELISA檢測方法具有較高的準確性。

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Development of enzyme－linked immunosorbent assay for heavy metal lead

YANG Yi－jin1，2WANG Jun－ping1，2WANG Jin1，2FANG Shu－bing1，2WANG Shuo1，2

（1.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety，Ministry of Education of China，Tianjin300457，China；2.Tianjin University of Science and Technology，Tianjin300457，China）

To prepare polyclonal antibody against heavy metal lead ion and develop an indirect competitive ELISA method.Lead was coupled to vector proteins keyhole limpet hemocyanin（KLH）and bovine serum albumin（BSA）via a bifunctional chelating agent ITCBE respectively，Pb（Ⅱ）－ITCBE－KLH was used as immunogen and Pb（Ⅱ）－ITCBE－BSA was used as coating antigen.The anti－Pb antibody was obtained after immunized to New Zealand white rabbits and an indirect competitive ELISA method was developed，by which the determination result was compared with that by ICP－MS method.The standard curve was developed with IC50of 3.48ng／mL and IC15of 0.32ng／mL，the total coincidence rate of the developed ELISA method and ICP－MS method was more than 97%.

heavy metal lead；polyclonal antibody；ic－ELISA

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.03.022

楊依錦（1987－），女，天津科技大學在讀碩士研究生。E－mail：yyj870319＠163.com

王碩

2012－01－11