水相酶解結合溶劑萃取生產花椒籽油工藝研究

吳珺婷秦禮康金 毅鄧 婷閔方卿

（1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貞豐縣頂罈椒業有限公司，貴州 貞豐 562201）

水相酶解結合溶劑萃取生產花椒籽油工藝研究

吳珺婷1秦禮康1金 毅1鄧 婷1閔方卿2

（1.貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽 550025；2.貞豐縣頂罈椒業有限公司，貴州 貞豐 562201）

采用水相酶解及有機溶劑萃取工藝生產花椒籽油。結果表明，得油率最高的優化工藝參數：纖維素酶和中性蛋白酶添加量分別為0.5%和7%，固液比1∶5（m∶V），酶解時間4h。該法游離油得率最高可達69.84%，毛油品質較好，有實際運用價值。

花椒；花椒籽油；水酶法

頂壇花椒 （Zanthoxylum planispinumvar.dintanensis）是竹葉椒變種，廣泛栽培于貴州省貞豐縣北盤江喀斯特河谷地區，迄今已有數百年的栽培歷史，香味及口感獨特，以“香味濃、麻味重、產量高”而著稱［1，2］。頂壇花椒果實采收后，果皮常作烹飪調料和中藥配料，可制成上好的花椒油，余下的為黑色有光澤的花椒籽［3］，約占花椒果實總重量1/2，長期以來卻因無有效方式利用作為農業廢棄物直接丟棄。經分析，花椒籽中油脂含量為15%～27%，其脂肪酸組成中90%為不飽和脂肪酸，而人體必需脂肪酸亞油酸和亞麻酸含量達45%以上［4，5］。因此，花椒籽油是生產保健食用油的理想原料。

目前，花椒籽油的提取方法主要有壓榨法、溶劑浸出法及超臨界CO2萃取［6－8］等。水酶法提油工藝是一種新興的提油方法，該法以機械和酶解為手段降解植物細胞壁，使油脂得以釋放，達到提取油脂的目的。與傳統工藝相比，具有溫和的處理條件、所提取的油純度高、色澤淺、酸值及過氧化物值低、操作時能耗低、污染少等優點。目前水酶法已應用于多種油料的提取［9－12］，但對于以水酶法提取花椒籽油還未見相關報道。本試驗采用水相酶解有機溶劑萃取法生產花椒籽毛油，從生產工藝、油脂品質及經濟成本等三方面與超臨界CO2萃取法、螺旋壓榨法和液壓法進行了比較，為進一步提高花椒籽綜合利用及花椒籽油工藝改進提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花椒籽：為貴州省貞豐縣北盤江喀斯特河谷地區成熟頂壇花椒，采摘后進行殼籽分離，并于常溫避光保存。

堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶：南京龐博生物工程有限公司。

試驗所用試劑：均為分析純。

1.2 儀器與設備

旋轉蒸發器：RE－5866A型，上海雅蓉生化設備儀器有限公司；

高速萬能粉碎機：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

電熱恒溫鼓風干燥箱：101A－2B型，上海錦昱科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 工藝流程

樣品→破碎→加入蒸餾水→沸水浴滅酶→冷卻調pH→加酶→水浴酶解→冷卻→破乳→3 500r/min離心10min→分離得上層液→旋轉蒸發→得油并記錄數據

1.3.2 原料制備 對花椒籽進行自然晾曬、初選、粉碎（20目）、（80±1）℃烘干后（水分＜10%），于干燥器中冷卻，避光處室溫密閉貯藏備用。

1.3.3 試驗設計 采用常規水酶法花椒籽酶解液進行水油分離對比試驗后，在相同加酶量下比較破碎方法、單一酶種與復合酶種對花椒籽游離油提取率的影響。為確定影響花椒籽籽游離油得率的主要因素，對酶種類及酶濃度、pH、固液比、酶解時間進行單因素試驗，并以游離油得率為評定指標。

1.4 分析測定方法

1.4.1 游離油得率 花椒籽游離油得油率按式（1）計算。

1.4.2 花椒籽品質分析

（1）含油率：NY/T 1285——2007《油料種籽含油量的測定 殘余法》；

（2）水分及揮發物：GB/T 14489.1——2008《油料 水分及揮發物含量測定》；

（3）蛋白質：GB/T 5009.5——2003《食品中蛋白質的測定》；

（4）灰分：GB/T 5009.4——2003《食品中灰分的測定》；

（5）纖維素：GB/T 5515——2008《糧油檢驗 糧食中粗纖維素含量測定 介質過濾法》。

1.4.3 油脂品質分析

（1）透明度、氣味、滋味檢驗：SN/T 0801.9——1999《進出口動植物油脂 透明度、氣味、滋味檢驗方法》；

（2）水分及揮發物檢驗：GB/T 5528——2008《動植物油脂 水分及揮發物含量測定》；

（3）不溶性雜質檢驗：GB/T 15688——2008《動植物油脂 不溶性雜質含量的測定》；

（4）酸值檢驗：GB/T 5534——2008《動植物油脂 酸值和酸度測定》；

（5）碘值檢驗：GB/T 5532——2008《動植物油脂 碘值的測定》；

（6）磷脂檢驗：GB/T 5537——2008《糧油檢驗：磷脂含量的測定》；

（7）皂化值檢驗：GB/T 5534——2008《動植物油脂 皂化值的測定》；

（8）維生素E檢驗：NY/T 1598——2008《食用植物油中維生素E組分和含量的測定 高效液相色譜法》。

1.5 統計分析

數據采用SPSS 16.0統計軟件分析。

2 結果與分析

2.1 花椒籽品質分析

由表1可知，本試驗中所采用花椒籽含油率為16.05%，且花椒籽的纖維素和蛋白質含量偏高，可以優先選擇纖維素酶和蛋白質酶進行酶解試驗。

表1 花椒籽品質分析結果Table 1 Results of quality analysis pricklyash peel seed /%

2.2 花椒籽酶解液分離工藝改進比較

篩選脫殼花椒籽經粉碎機粉碎后按一定固液比加入蒸餾水，85℃滅酶10min，冷卻至室溫后加入0.05mol/L檸檬酸緩沖液調節至酶最適pH值，勻成漿料后按一定的m（酶）∶m（籽）（干基計）加入酶制劑，50℃下酶解一定時間，破乳后3 000r/min離心后得到游離油、乳狀液、水解液及渣。

本試驗以常規水酶法工藝酶解花椒籽后，酶解分離僅獲得少量油及大量乳狀液。乳狀液采用13 000g高速離心、超聲波、反復凍融法及調節pH值破乳，但均無法完成油水分離，故采用有機溶劑從酶解液中提取油脂。比較有機溶劑無水乙醇、無水乙醚、石油醚、正己烷、乙酸乙酯提取酶解液效果，由圖1可知，酶解乳狀液經正己烷處理析出情況較好，游離油得率達到42.60%。

圖1 不同浸出溶劑提取花椒籽游離油得油率的比較Figure 1 The comparison of free oil yield ratio of pricklyash peel seed extracted by different solvent

選擇正己烷作為提油溶劑，通過反復的驗證試驗，確定了本試驗水相酶解有機溶劑萃取工藝流程為篩選花椒籽，去除雜質，粉碎（60目）后按固液比1∶4（m∶V）攪勻成漿，沸水浴1h滅酶，冷卻后調節至最適pH值，加酶后在水浴中50℃加熱酶解一定時間（120r/min攪拌）；冷卻后加入正己烷150mL繼續攪拌10min，3 500r/min離心10min，上層清液經旋轉蒸發后得毛油。

2.3 水酶法酶種及酶反應條件的確定

2.3.1 花椒籽破碎方法對游離油得率的影響 油料的破碎方法分為干碾壓法和濕研磨法。一般而言，對于初始水分含量較高的油料種籽（如可可籽），常采用濕法破碎；對于花生，濕法破碎的結果是產生非常穩定的乳狀液，從而影響游離油提取的工藝難度。由于花椒籽初始水分含量約為11%，采用干法破碎較為合適，這樣既可以減少能耗又可以在一定程度上避免破碎過程中形成穩定的乳狀液。

2.3.2 酶的種類對得油率的影響 儲存在油料細胞內部的油脂，通常同蛋白質和碳水化合物等大分子結合，構成如脂多糖、脂蛋白等復合體［13］。只有通過破壞油料組織的油脂復合體及細胞結構，才能獲得其中的油脂。通過機械破碎，結合對油料組織以及脂多糖、脂蛋白等復合體有降解作用的酶處理油料的方法更易于提取植物油料中的油脂成分。酶能破壞細胞壁，對油料組織中的脂蛋白及脂多糖有分解作用，也可增加油料組織中油的流動性達到提高出油率的目的。酶法提油中常采用的酶類主要有：纖維素酶（CE）、半纖維素酶（HE）、蛋白酶（PR）、果膠酶（PE）、α－聚半乳糖醛酸酶（α－PG）、α－淀粉酶（α－AM）、β－葡聚糖酶（β－GL）等［11］。

在固定酶反應條件前提下，分別比較α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶在單一酶酶解花椒籽對游離油得率的影響。反應條件為加酶量1%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，pH 7.0，時間4h，結果見圖2。由圖2可知，對比未添加酶試驗，添加α－淀粉酶、菠蘿蛋白酶、果膠酶對花椒籽提油率沒有顯著影響。而酸性蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、纖維素酶添加后游離油得率較其余3種酶增加明顯，其中纖維素酶的游離油得率為9.5%。

圖2 單一酶對花椒籽游離油得率的影響Figure 2 Effects of single enzyme on free oil yield ratio of pricklyash peel seed

2.4 復合酶條件對得油率的影響

一般情況下，復合酶系的作用效果優于單一酶，油脂得油率會顯著提高［14］。單一的酶對提高游離油得率作用有限。試驗將多種酶的單一使用效果和復合使用效果進行對比，選取最適合于提取花椒籽油的酶的種類。參考文獻［15］，在前期大量預試驗基礎上，采用纖維素酶為主，復配其它蛋白酶的組合對花椒籽進行水酶法提油試驗。

2.4.1 中性蛋白酶和纖維素酶的復合效果 固定纖維素濃度為0.5%，分別添加5%的α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶和中性蛋白酶，反應條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時間4h，pH 7.0，結果見圖3。由圖2和圖3可知，添加復合酶能有效提高游離油得率。其中作用最明顯的是中性蛋白酶和纖維素酶，游離油得率達到50.39%。分析原因，花椒籽含有較多的蛋白質和纖維素，這兩種酶的添加能夠有效地破壞細胞壁的纖維素及與脂類結合的蛋白結構，從而充分的釋放細胞壁中的油脂。α－淀粉酶、果膠酶、菠蘿蛋白酶與纖維素酶復合效果明顯低于其余3種酶，可能與花椒籽粉碎后的結構有關，有待進一步分析。

圖3 復合酶對花椒籽游離油得率的影響Figure 3 Effects of complex enzyme on free oil yield ratio of pricklyash peel seed

2.4.2 中性蛋白酶的濃度對游離油得率的影響 固定纖維素酶濃度為0.5%，增加中性蛋白酶濃度，反應條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50 ℃，時間4h，pH 7.0，結果見圖4。

圖4 中性蛋白酶濃度對游離油得率的影響Figure 4 Effects of neutral protease concentration on free oil yield

由圖4可知，隨著酶濃度增加，游離油得率也逐漸增加。說明加酶量越大，蛋白質的解離程度越徹底，油更易釋放。加酶量為1%～5%時，游離得油率緩慢上升，當加酶量超過7%（V∶m）時，游離得油率增加緩慢，因此選擇中性蛋白酶濃度為7%（V∶m）。

2.4.3 纖維素酶的濃度對游離得油率的影響 固定中性蛋白酶濃度為7%，增加纖維素酶濃度，反應條件為固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時間4h，pH 7.0，結果見圖5。由圖5可知，隨著纖維素酶濃度增加，游離油得率也逐漸增加。說明加酶量越大，纖維結構被破壞的程度越徹底，油更易釋放。當加酶量超0.5%（V∶m）時，游離油得率增加緩慢，因此選擇纖維素酶濃度為0.5%（V∶m）。

圖5 纖維素酶濃度對游離油得率的影響Figure 5 Effects of cellulose concentration on free oil yield

2.4.4 pH對游離油得率的影響 固定纖維素酶和中性蛋白酶加酶量，研究pH值變化對游離油得率的影響，反應條件為纖維素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時間4h，結果見圖6。pH影響蛋白質的溶解度，蛋白質的溶出可提高游離油得率，為使蛋白酶能充分作用，必須通過提高pH值增大蛋白質溶解量。本試驗選用了纖維素酶和中性蛋白酶，根據所選酶的種類確定酶解時的pH，pH的選擇應在酶的最適pH范圍內，使酶和底物反應充分。纖維素酶的最適pH值為3.8～7.0，中性蛋白酶的最適pH值為7.0～8.0。從圖6可看出，pH 7.0的游離油得率達到最大。

圖6 pH值對游離油得率的影響Figure 6 Effects of pH value on free oil yield

2.4.5 固液比對游離油得率的影響 固定下列條件，纖維素酶0.5%，中性蛋白酶7%，固液比1∶6（m∶V），酶解溫度50℃，時間4h，研究固液比對游離油得率的影響。由圖7可知，當固液比為1∶5（m∶V）時游離油得率最高，表明在此條件下酶解最為充分。

圖7 固液比對游離油得率的影響Figure 7 Effects of solid－to－liquid ratio on free oil yield

2.4.6 酶解時間對游離油得率的影響 由圖8可知，酶解4h前，隨著反應時間的延長，游離油得率明顯增加；4h后游離油得率增長緩慢。由于反應時間過長會影響油的品質，因此選定復合酶作用時間為4h。綜上所述，纖維素酶和中性蛋白酶的最適酶解條件：固液比為1∶5（m∶V），于50℃，pH 7.0下添加0.5%（V∶m）纖維素酶和7%中性蛋白酶（V∶m），酶解4h。

圖8 酶解時間對游離油得率的影響Figure 8 Effects of enzymolysis duration on free oil yield

目前水相酶解結合溶劑萃取制得花椒籽毛油的游離油得率最高可達69.84%（原料含油率16.05%）。通過以上試驗，對制備花椒籽油的工藝條件有了初步研究，在本試驗的下一階段工作中將對水相酶解結合溶劑萃取制備花椒籽油進行工藝優化研究。

2.5 不同方法制取毛油品質的評價

在試驗室采用水相酶解有機溶劑萃取法、超臨界CO2結合夾帶劑（無水乙醇）萃取法、螺旋榨油法、液壓榨油法分別以最優條件［16］對花椒籽進行壓榨制得毛油，并進行油脂品質分析與比較，結果見表2。

表2 不同方法制取花椒籽毛油各項品質指標Table 2 Quality indexes of pricklyash peel seed oil based on various methods

超臨界CO2萃取法、水相酶解有機溶劑萃取法、液壓法3種工藝油碘價相差不大。僅超臨界CO2萃取油中檢出VE（0.13mg/100g）；同超臨界CO2萃取油相比，液壓法制得花椒籽油的酸價、過氧化值、皂化價和酸價偏高，其他品質指標均較接近，總體品質較好。水相酶解有機溶劑萃取法的酸價、過氧化值和磷脂最高，皂化價偏低，有輕微溶劑殘留氣味，品質較差。螺旋壓榨法提取油出油率極低，品質最差，無法作為食用油使用。

3 結論

（1）高速離心、超聲波、反復凍融法及調節pH值法難以提取出花椒籽酶解液中的油脂。采用有機溶劑從酶解液中提取油脂，結果表明酶解液經正己烷處理能完全析出，且所提油脂溶劑殘留較少，溶劑可回收重復使用。

（2）復合酶處理花椒籽提油效率優于單一酶，選用纖維素酶＋中性蛋白酶酶解花椒籽結合溶劑萃取法提取花椒籽油高于其它組合。加酶量選擇纖維素酶（0.5%）和中性蛋白酶（7%）；固液比1∶5（m∶V）時得油率最高，表明在此條件下酶解最充分；經篩選酶解時間為4h最佳。

（3）水相酶解有機溶劑萃取工藝流程：篩選花椒籽，去除雜質，粉碎（60目）后按固液比1∶5（m∶V）攪勻成漿，沸水浴1h滅酶，冷卻后調節至酶最適pH值，加酶后在水浴中加熱酶解4h（120r/min攪拌）；冷卻后加入正己烷150mL繼續攪拌10min，3 500r/min離心10min，上層清液經旋轉蒸發后得毛油。

（4）超臨界CO2結合夾帶劑萃取青花椒籽油，食用品質最佳，但成本較高，其工業應用的經濟可行性低。水相酶解有機溶劑萃取毛油品質較佳，游離油得率試驗中最高可達69.84%（原料含油率16.05%），油脂品質較優，可進一步改進酶解能力、提油方法及后期精煉工藝以提高出油量和油質，具有較大的改進空間，對花椒籽制油及水酶法工藝研究具有一定的參考價值。

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Oil－producing technology of extractingZan thoxylum（pricklyash peel）seed oil by aqueous enzymatic extraction with solvent－extraction

WU Jun－ting1Qin Li－kang1JIN Yi1DENG Ting1MIN Fang－qing2

（1.College of Life Science University，Guiyang，Guizhou550025，China；2.Dingtan Pepper Industry Co.，Ltd，Zhenfeng，Guizhou562201，China）

Using from the organic solvent extract grease liquid of Huajiao seed from the enzymatic solution，the results showed that the enzyme solution were handled by hexane liquid could fully separate out，and proposed grease solvent residual less，solvent could be recycled.Composite enzyme treatment of Huajiao seed oil efficiency was superior to single enzyme.Considering the economic costs，plus enzyme quantity selection cellulose enzyme（0.5%）and neutral protease（7%）；Solid－liquid ratio to the highest rate when oil was 1∶5（m∶V），showed that in these conditions zymolysing most fully，and screening enzyme time for 4hbest.

Zanthoxylum planispinum（pricklyash peel）；Zanthoxylun bungeanumseed oil；enzymatic hydrolysis

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.033

國家科技部、財政部富民強縣專項行動計劃（編號：H090034）

吳珺婷（1986－），女，貴州大學在讀碩士研究生。E－mail：foryoe＠126.com

秦禮康

2011－12－01