甲磺酸伊馬替尼聯合塞來昔布對胃腸間質瘤細胞增殖及凋亡的影響

[摘要] 目的 觀察甲磺酸伊馬替尼和塞來昔布聯合對胃腸間質瘤細胞增殖及凋亡的影響。 方法 甲磺酸伊馬替尼及塞來昔布單獨或聯合處理胃腸間質瘤細胞株GIST-T1，MTT法檢測藥物對胃腸間質瘤細胞株的生長抑制，Western blot檢測Bax及Bcl-2蛋白表達。 結果 甲磺酸伊馬替尼與塞來昔布聯合應用顯著增強甲磺酸伊馬替尼對胃腸間質瘤細胞增殖；和甲磺酸伊馬替尼及塞來昔布單用相比，二者聯用后胃腸間質瘤細胞Bax表達增高及Bcl-2表達降低。 結論 甲磺酸伊馬替尼和塞來昔布聯合應用顯著抑制胃腸間質瘤細胞增殖，可能和促腫瘤細胞凋亡有關，其機制可能與Bax表達上調及Bcl-2表達下調有關。

[關鍵詞]胃腸間質瘤；甲磺酸伊馬替尼；塞來昔布

[中圖分類號] R735 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2012）22-22-03

Influence of imatinib mesylate combined with celecoxib on proliferation and apoptosis of gastrointestinal stromal tumor cells

LV Huifang1 ZHANG Zhandong2 XU Chunmiao3 CHEN Xiaobing1 CHEN Beibei1

LI Ning1 LUO Suxia1 HUA Yawei2

1.Department of Internal Medicine，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China；2.Department of General Surgery， Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China；3.Department of Radiology，Henan Cancer Hospital，Zhengzhou 450008，China

[Abstract] Objective To observe the effect of IM combined with celecoxib on proliferation and apoptosis in gastrointestinal stromal tumor cells. Methods GIST-T1 cells were treated with IM or celecoxib or in combination. MTT was used to determine the inhibition of GIST-T1 cells and Western blot was used to detect the expression of Bax and Bcl-2 in cancer cells. Results After treatment with IM combined with celecoxib，the inhibitory effect of proliferation was significantly stronger than those of IM or celecoxib alone（P<0.05）. In comparison with IM or celecoxib alone，the level of Bax expression was higher and the level of Bcl-2 expression was lower in GIST-T1 cells treated by both two drugs. Conclusion The combination of Imatinib mesylate and celecoxib may inhibit the cell proliferation，which might be associated with the promotion of apoptosis. The mechanism probably correlates with the upregulation of Bax and the downregulation of Bcl-2 in gastrointestinal stromal tumor cells.

[Key words] Gastrointestinal stromal tumor；Imatinib mesylate；Celecoxib

胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor，GIST）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，對傳統放、化療不敏感，手術切除為其主要治療手段，但術后5年生存率較低，容易出現復發轉移，預后差[1]。目前研究顯示，甲磺酸伊馬替尼可作為治療晚期GIST的主要藥物。但有研究顯示，80%的GIST患者可從甲磺酸伊馬替尼（imatinib mesylate，IM）治療中受益，仍有20%的患者出現耐藥，病情進展，3年生存率為69%～74%[2]。近年來研究發現，GIST高表達環氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2），而選擇性COX-2抑制劑可抑制多種腫瘤細胞的生長及誘導細胞凋亡[3-4]。本研究旨在探討COX-2抑制劑塞來昔布（Celecoxib）與抗腫瘤藥甲磺酸伊馬替尼聯合應用對胃腸間質瘤細胞體外抗瘤效應及其機制。

1 材料與方法

1.1 細胞培養

人胃腸間質瘤細胞株GIST-T1細胞由日本高知大學惠贈，培養于含10%小牛血清RPMI-1640培養液中，內含青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 U/mL），于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養。

1.2 實驗主要試劑及儀器

甲磺酸伊馬替尼購于瑞士諾華公司；COX-2抑制劑塞來昔布膠囊購于大連輝瑞制藥有限公司；二甲基亞砜（DMSO）及四甲基偶氮唑藍（MTT）購自美國Sigma公司；鼠抗人Bax及Bcl-2一抗及羊抗鼠二抗購自美國Santa Cruz公司。

1.3 MTT檢測細胞生長抑制率

取對數生長期細胞制備細胞懸液，以1×104個/孔濃度接種細胞至96孔板中，常規培養24 h，分別加入含塞來昔布的PRMI1640培養基，濃度分別為0.1、1、10、100、1 000 μmol/L，同時設陰性對照組和空白組，每個梯度設3個復孔。繼續培養72 h后，每孔加入MTT溶液100 μL，4 h后離心，棄去孔中液體，加入DMSO150 μL/孔，10 min后，應用全自動酶標儀，于570 nm波長處測定吸光度（A）值，計算生長抑制率，繪制細胞生長抑制曲線，計算塞來昔布抑制GIST-T1細胞增殖的藥物半效抑制濃度（IC50）。

將處于對數生長期的GIST-T1細胞接種于96孔板中，常規培養24 h，分別加入含塞來昔布（10μmol/L）、甲磺酸伊馬替尼（10μmol/L）以及塞來昔布（10μmol/L）聯合甲磺酸伊馬替尼（10μmol/L）的培養基，繼續培養72 h后，每孔加入MTT溶液100 μL，4 h后離心，加入DMSO 150μ /孔，應用全自動酶標儀測定吸光度（A）值，按下述公司計算細胞生長抑制率：生長抑制率=（A對照組-A實驗組）/（A對照組-A空白組）×100%。

1.4 Western blot檢測Bax/ Bcl-2蛋白水平表達

分別收集實驗組與對照組細胞提取總蛋白，通過聚丙烯酸胺凝膠電泳分離蛋白樣本。將蛋白樣本轉移至PVDF膜上，蛋白封閉液37℃封閉1 h，PBST洗滌，分別用鼠抗人Bax、Bcl-2單克隆抗體（1︰1 000） 4℃振蕩孵育過夜，TBST洗滌3次，加HRP標記的兔抗鼠IgG抗體二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，每次5 min。增強型化學發光試劑盒處理，X線曝光，測量其灰度值，以β-actin為內參，分別計算各組A值（標本灰度值/內參灰度值）。

1.5 統計學分析

數據采用SPSS 13.0軟件進行處理，以（）表示，使用單因素方差分析和SNK檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 塞來昔布對GIST-T1細胞的生長抑制

MTT結果顯示，隨著塞來昔布濃度的增加，其對GIST-T1細胞的生長抑制作用也明顯增強，呈現劑量依賴性，塞來昔布對GIST-T1細胞的生長抑制曲線見圖1，具體數值見表1。GIST-T1細胞的IC50約為10 μmol/L。

2.2 甲磺酸伊馬替尼聯合塞來昔布對GIST-T1細胞的生長抑制

MTT結果顯示，甲磺酸伊馬替尼（10 μmol/L）與塞來昔布（10 μmol/L）聯合可顯著增強甲磺酸伊馬替尼對GIST-T1的生長抑制，甲磺酸伊馬替尼與塞來昔布聯合作用GIST-T1細胞24 h、48 h和72 h后，其生長抑制率明顯高于塞來昔布組和甲磺酸伊馬替尼組，差異有統計學意義（P<0.05），且隨作用時間的延長，塞來昔布與伊馬替尼聯合用藥組不同時間點之間的生長抑制率差異也有統計學意義（P<0.05）。見表2、圖2。

2.3 磺酸伊馬替尼聯合塞來昔布對細胞凋亡的影響

用Western blot檢測GIST-T1細胞Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表達。結果顯示，甲磺酸伊馬替尼與塞來昔布聯合用藥組Bax的表達顯著高于甲磺酸伊馬替尼組和塞來昔布組，而聯合用藥組Bcl-2的表達顯著低于甲磺酸伊馬替尼組和塞來昔布組。見圖3。

3 討論

甲磺酸伊馬替尼是目前治療胃腸間質瘤的重要方法之一，但仍有10%～20%的患者出現耐藥，成為治療的主要障礙。因此，尋找新的治療方案成為胃腸間質瘤治療的研究方向之一。

COX是一種限速酶，可將花生四烯酸代謝成各種前列腺素產物，參與多種病理生理過程。COX有COX-1和COX-2兩種同工酶，COX-2一般靜息時不表達，僅在細胞受到各種刺激時開始迅速表達。COX-2參與多種腫瘤的發生及發展，其過表達可通過以下幾種機制促進腫瘤形成：增加細胞外基質蛋白的粘連，抑制丁酸鹽誘導的凋亡，降低E-鈣粘素和轉化生長因子β2受體的表達，刺激Bcl-2蛋白的表達，COX-2過表達還可產生的血管生成因子，促使腫瘤血管形成[5-6]。近年來研究發現，胃腸間質瘤中COX-2高表達，可能促進腫瘤細胞增殖、浸潤及轉移，和腫瘤預后相關[7- 8]。本研究將COX-2抑制劑塞來昔布聯合甲磺酸伊馬替尼作用于胃腸間質瘤細胞，觀察細胞增殖的變化。結果提示，和甲磺酸伊馬替尼單藥相比，甲磺酸伊馬替尼聯合塞來昔布可顯著抑制胃腸間質瘤細胞的增殖。

Bax和Bcl-2是重要的細胞凋亡調控基因，分屬于Bcl-2家族中的促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白。Bax和Bcl-2表達程度及其比例決定細胞接受凋亡信號后的命運，上調Bax/ Bcl-2則促進凋亡，而下調Bax/ Bcl-2則抑制凋亡。目前研究發現，甲磺酸伊馬替尼在體外能抑制c-KIT活化的腫瘤細胞的增殖并誘導其凋亡[9]。筆者在甲磺酸伊馬替尼的基礎上聯合COX-2抑制劑塞來昔布，觀察聯合用藥對胃腸間質瘤細胞凋亡的影響。本研究結果顯示，聯合用藥后，Bax表達增加，Bcl-2表達降低，Bax/Bcl-2比值上調，提示甲磺酸伊馬替尼和塞來昔布聯用可能促進腫瘤細胞凋亡，其機制和Bax/Bcl-2比例失調有關。

綜上所述，甲磺酸伊馬替尼聯合塞來昔布可顯著抑制胃腸間質瘤細胞的增殖，可能與促細胞凋亡有關，其機制可能和Bax表達上調，Bcl-2表達下調有關。本研究為胃腸間質瘤的治療提供一個新的思路，其具體的作用機制仍需進行進一步研究。

[參考文獻]

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（收稿日期：2012-08-16）