三種細菌培養痰標本預處理方法學評價

[摘要] 目的 在痰標本細菌培養中，對三種痰標本預處理方法進行評價。 方法 收集合格痰標本80份，同時采用三種不同的方法預處理后接種培養基。以直接培養法為對照，比較它們的陽性率差異。 結果 經預處理后接種培養法陽性率均比直接培養法高，差異有統計學意義（P < 0.05）。3種方法間比較陽性率無統計學意義（P > 0.05）。 結論 洗痰碎痰法操作簡單，成本低廉，耗時很短，處理后的痰標本幾乎沒有雜菌干擾，建議在預處理痰標本時推廣應用。

[關鍵詞] 痰；預處理

[中圖分類號] R446.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2012）28-0101-02

由于痰液標本留取過程中極易污染上呼吸道定植菌，為盡量減少干擾，在痰培養接種前要對痰標本進行預處理。本文介紹三種痰液標本預處理的方法，并結合實際工作對這些方法的應用進行評價。

1 材料與方法

收集呼吸科肺部感染患者合格痰標本80份，以直接接種為對照，同時采用以下三種方法預處理后接種平板培養。

1.1 生理鹽水洗滌法

將痰加入含有15～20 mL滅菌生理鹽水的試管中，劇烈振蕩5～10 s，然后用接種環將沉淀于管底的膿痰小片沾出，再放入另一試管中以同樣方法重復兩次，最后將余下的膿痰接種在培養基上[1]。

1.2 痰均質化法

向痰液（洗滌后）標本中加入等量的消化液，分解蛋白使痰液均質化后再接種，主要有如下幾種消化液：

1.2.1 胰酶溶液 取1∶250胰酶干粉1 g加入100 mL滅菌PBS或生理鹽水中，調pH值為7.6即為1%的胰酶應用液。使用時向痰液內加入等量的胰酶應用液，37℃恒溫90 min即可使痰液均質化[1]。

1.2.2 α-糜蛋白酶溶液 工作原理同胰酶溶液相似。

1.2.3 二硫蘇糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液 兩者均是強還原劑，作用于粘蛋白的二硫鍵使痰液均質化。

1.2.4 H2SO4消化法 僅適用于結核分枝桿菌培養。將痰標本加入等量的4%H2SO4混勻，放35～37℃ 20 min（粘稠標本在放置期間要振蕩數次）促使其液化對痰中的雜菌進行處理。然后取出，3000 r/min，5 min離心棄去上清，加BTB指示劑1～2滴，用40 g/L NaOH中和（終點為淡綠色），將其接種于改良羅氏培養基[2]。

1.2.5 熱處理和酸處理 適用于軍團菌分離培養。酸處理液（KCL-HCL）由0.2 mol/L KCL和0.2 mol/L HCL以18∶1比例混合而成，pH=2.2，二者混合后置于玻璃管中加蓋高壓滅菌待用。取200 μL經SPUTASOL消化液處理后液化的痰液，50℃水浴30 min后再加入等量的酸處理液，放置10～15 min，離心棄上清液，加1 mL雙蒸水洗滌1次，離心棄上清液，再加200 μL雙蒸水混勻后取50 μL接種軍團菌BCYE-DGVPC培養基[3]。

1.3 洗痰碎痰法

1.3.1 材料準備 ①無菌痰盒；②青霉素小瓶；③紗布；④小玻璃珠；⑤無菌生理鹽水。向青霉素小瓶內加入1～2 mL無菌生理鹽水和2～3顆小玻璃珠，加蓋并用紗布封扎瓶蓋，110℃高壓滅菌15 s取出備用。

1.3.2 操作步驟 無菌痰盒取來合格的痰標本，加入無菌生理鹽水洗滌至少3次。洗滌時直接將無菌生理鹽水倒入痰盒中，用接種環拉住痰標本來回拖動，如此反復多次便能較徹底地洗去口腔中的定植菌。然后用接種環挑取已洗過三遍的痰標本放入備用的青霉素小瓶內，振搖1～2 min，使塊痰變成碎痰，痰內的細菌游離于無菌生理鹽水中即可接種平板[4]。

1.4 統計學方法

以各種預處理方法獲得病原菌標本數占各組標本數的百分率分別計算陽性率，各組間比較采用χ2檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

見表1、2。

表1 三種方法痰標本預處理后接種培養結果分別與對照組比較

3討論

表1、2顯示，痰標本不經預處理直接接種培養陽性率最低，與經預處理后接種培養陽性率比較均有顯著性差異（P <0.05）。三種預處理方法中，陽性率從高到低順序排列是洗痰碎痰法、胰酶均質化、生理鹽水洗滌法。洗痰碎痰法與胰酶均質化法比較陽性率接近，無顯著性差異（P > 0.05）。生理鹽水洗滌法與其他兩種方法比較，陽性率雖略低，但亦無顯著性差異（P > 0.05）。

生理鹽水洗滌法簡便易行，但由于試管面積不夠大，洗痰不夠徹底，痰在試管內不易搖碎，接種時不一定能得到真正的感染菌或致病菌；另外痰標本多次移動，容易丟失最有價值的部分，操作時需要非常小心。

痰均質化法中胰酶溶液是臨床實驗室最常使用的痰消化液，價廉效果好，對細菌生長幾無影響，但消化耗時較長，應用液常溫下不易保存（配制后-20℃僅保存10 d），且反復凍融容易失效，臨用前配制效果更好。α-糜蛋白酶溶液消化能力更強，消化所需時間更短，但價格昂貴，成本較高。二硫蘇糖醇溶液（SPUTASOL消化液）和N-乙酰-L-半胱氨酸溶液方便保存，效期較長，已有配制好的商品試劑出售，但對細菌生長有輕微的抑制作用。柯俊等[5]報道痰標本采用SPUTASOL消化液預處理的時間對流感嗜血桿菌的檢出率有較大影響，消化液處理后15 min接種比30 min后接種流感嗜血桿菌的檢出率要高。

洗痰碎痰法方法操作簡單，材料易得，不需要特殊試劑，成本低廉，耗時很短，處理后的標本幾乎沒有雜菌干擾，建議在細菌室預處理痰標本時推廣應用。

[參考文獻]

[1] 葉應嫵，王毓三，申子瑜. 全國臨床檢驗操作規程[M]. 第3版.南京：東南大學出版社，2006：744-745.

[2] 陳東科，孫長貴. 實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛生出版社，2011：145-146.

[3] 宣瑞紅，胡朝暉，王娟，等. 臨床標本軍團菌分離方法研究[J]. 國際檢驗醫學雜志，2010，31（6）：593-594.

[4] 王惠萱，李雪梅，滕毅，等. 臨床痰標本檢驗前期處理新方法研究[J]. 國際檢驗醫學雜志，2010，31（8）：898-899.

[5] 柯俊，陳媛，陶治洲，等. 痰標本預處理對細菌學檢驗結果的影響[J].檢驗醫學與臨床，2008，5（13）：814-815.

（收稿日期：2012-12-08）